Developmental Biology- Research Projects
| [1.] | Development of the central nervous system: The Midbrain Hindbrain Organizer |
| [2.] | Genetik der Steuerung der Differenzierung dopaminerger Neuronen in Zebrafischembryonen |
| [3.] | Molecular mechanisms controlling pancreas organogenesis and differentiation of pancreatic cell types. |
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[1.] Development of the central nervous system: The Modbrain Hindbrain Organizer
Die grundlegende Organisation des Wirbeltiergehirns wird bereits während der Gastrulation und Neurulation angelegt. Anterioposteriore Signalgradienten geben Positionsinformation zur Etablierung von Grenzen zwischen den Hauptdomänen des sich bildenden Gehirns. Diese Grenzen entwickeln sich zu wichtigen regionalen Organisationszentren für die weitere Musterbildung und neuronale Differenzierung. Die Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze (MHB), auch Isthmus genannt, ist ein wichtiges Signalzentrum, das an der Musterbildung der Anlagen des Mittelhirns und anterioren Hinterhirn von späten Gastrulationsstadien an entscheidend beteiligt ist. Gegen Ende der Gastrulation initiieren pax2, en, wnt1 und FGF8 Regelkreise, die zur Aufrechterhaltung der MHB als Signalzentrum bis in die späte ZNS-Entwicklung beitragen. wnt1 und FGF8 sind auch Signale, die Induktions- und Differenzierungsleistungen der MHB vermitteln. Die Positionierung der MHB in der Neuralplatte wird durch die Grenzen der otx2 und gbx2 Expressionsdomänen bedingt. Es ist jedoch noch unklar, welche Gene den Beginn der Expression von pax2, wnt1 und FGF8 initiieren. Ziel dieses Teilprojektes ist es, die Mechanismen, die zur Initiation des MHB - Organisators führen, zu verstehen. In spiel ohne grenzen (spg) mutanten Zebrafish Embryonen bildet sich kein Isthmus: das Cerebellum fehlt und Defekte reichen bis in das posteriore Tektum. In spg Mutanten wird der MHB - Organisator nicht richtig initiiert: In der Mitte der Neuralplatte und später im ventralen Bereich werden Isthmus spezifische Gene nicht exprimiert, im lateralen Bereich der Neuralplatte ist die Expression dieser Gene stark reduziert. Wir konnten zeigen, daß der spg Phänotyp durch Mutationen im Zebrafisch pou2 Gen bewirkt wird. pou2 wird im Zebrafisch gegen Ende der Gastrulation, zu der Zeit, zu der auch der MHB-Organisator initiiert wird, im Mittelhirn und anterioren Hinterhirn exprimiert.
In diesem Teilprojekt sollen die folgenden Fragestellungen zum Mechanismus der Initiation der MHB untersucht werden:
1. Die dorsoventrale Modulation des spg Phänotyps weist auf eine Beteiligung vertikaler Signalwege ausgehend vom axialen Mesoderm. Spielt spg eine Rolle bei der Kontrolle der FGF4 Expression, das eines der vertikalen Signale sein soll?
2. Identifikation der Gene, die die Expression von Pou2 in der MHB Region kontrollieren. Dazu sollen Gene untersucht werden, die mit pou2 koexprimiert werden; es wird die Epistasie mit anderen Mutanten untersucht, und es sollen in einer Mutagenese neue Regulatoren von pou2 gefunden werden.
3. Identifikation von Zielgenen, die durch pou2 im Rahmen der Initiation der MHB reguliert werden. Dazu werden Kandidatengene, die auf Grund ihres Expressionsmusters identifiziert wurden, auf Veränderung der Expression in spg Mutanten untersucht.
4. Fusionen des pou2 Proteinprodukts mit Aktivator- bzw. Repressordomänen werden zeigen, ob Pou2 Zielgene aktiviert oder reprimiert.
5. Untersuchung, ob die maternale Expression von pou2 eine Rolle bei der Musterbildung in der Neuralplatte spielt.
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[2.] Genetik der Steuerung der Differenzierung dopaminerger Neuronen in Zebrafischembryonen
Neurodegenerative Erkrankungen stellen eine der Haupteinschränkungen der Lebensqualität der alternden Bevölkerung in modernen Gesellschaften dar. Obwohl der Morbus Parkinson heute als degenerative Erkrankung des dopaminergen Systems im Zentralnervensystem verstanden wird, gibt es keine Therapien zur Prävention oder Heilung der Krankheit. Seit einigen Jahren haben wir in einem einfachen Wirbeltiersystem, dem Zebrafisch (Danio rerio) genetische Modelle zu Defekten im dopaminergen System entwickelt. Dabei haben in unserem Labor isolierte Mutanten sowohl in anderen Systemen charakterisierte wichtige Funktionen zur Differenzierung catecholaminerger Neuronen bestätigt (in der soulless Mutation / Phox2a) als auch vollständig neue Komponenten aufgedeckt (bei der foggy Mutation, einem Homologen des Spt5 Faktors der Transkriptions-Elongation). In einer neuen Mutagenese haben wir 16 neue Mutanten identifiziert, die Defekte in der Bildung Tyrosin-Hydroxylase (TH) exprimierender Zellen im Zebrafisch-Embryo entwickeln. Unsere genetischen Suchen nach Genen mit wichtigen Funktionen eröffnen Ansatzpunkte zu Forschungskonzepten zur Prävention und zu regenerativen Therapien. Die konkreten Ziele des Projektes sind:
(1) Die Phänotypen der neuen Mutationen sollen im Detail auf Veränderungen in der regionalen Musterbildung und Bildung des dopaminergen Systems hin untersucht werden. Durch Kreuzen von Doppelmutanten sollen Interaktionen zwischen den beteiligten Genen aufgedeckt werden. Es werden transgene Fische hergestellt, die EGFP vom Tyrosin-Hydroxylase Promoter exprimieren. Durch Einkreuzen in die mutanten Stämme kann der Einfluß der Mutation auf die catecholaminerge Differenzierung in vivo untersucht werden.
(2) Neun mutierte Gene mit Defekten im diencephalen dopaminergen System und Locus coeruleus sollen genomisch kartiert werden. Aus den EST Projekten und vergleichender Genomanalyse sollen Kandidatengene für die mutanten Loci identifiziert werden und durch meiotische Feinkartierung ihre Identität mit den betroffenen Loci getestet werden. Andere Gene sollen über Positionsklonierung untersucht werden.
(3) Die Funktion neu identifizierter Gene soll durch experimentell embryologische Ansätze aufgeklärt werden.
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[3.] Molecular mechanisms controlling pancreas organogenesis and differentiation of pancreatic cell types.
The objective of this proposal is to elucidate the molecular mechanisms controlling development of the pancreas. We will identify molecular factors involved in the differentiation of the pancreatic cell types, with a special attention to the endocrine beta cell type, whose crucial importance stems from its unique ability to produce the metabolic hormone insulin, and from its direct involvement in pathogenesis of diabetes.
The present research project comprises four stages. The first stage concerns the identification and the cloning of regulatory genes controlling the development of pancreas and the differentiation of the various pancreatic cell types. This part, representing the major task of the project (7 workpackages), will be accomplished by a multidisciplinary approach : i) through a genetic screening for mutations affecting pancreas organogenesis in zebrafish; ii) by the identification of signaling pathways involved in pancreas development and then by the isolation of gene family members known to act within these signaling pathways; iii) by a systematic screening of genes expressed in a cell type-specific fashion, specially in the endocrine beta cell. The second stage of the project will be the detailed analysis of the expression pattern for each identified gene in developing zebrafish and mouse. These experiments will guide us towards those genes most likely to be of biological relevance, and therefore worthy of attention in the context of functional studies. In the third part of the project, we will determine the actual function of the identified genes. The zebrafish will permit a rapid functional evaluation of each factor through microinjection of appropriate RNA molecules (coding for wild type factors or dominant negative mutants) and through the use of a stable GAL4/UAS expression system. Genes showing significant effects on pancreas development will be further tested in mouse, both in pancreas explants, and using gene disruption technology to determine unequivocally the importance of gene function in pancreatic organogenesis. Pancreatic and beta cell defects in the resulting mice will be examined and compared with human pathologies, particularly diabetes. Finally, the fourth task of the project will be to integrate all the data obtained to elaborate a detailed model describing the regulatory cascade controlling pancreatic and beta cell development, including both cell-cell and cell-autonomous signalling mechanisms. This model will be tested on murine embryonic stem cells by checking whether pancreatic and beta cell differentiation can be recapitulated by successive expressions of key pancreatic regulatory factors.
EU Collaborative Project with
- Bernard Peers (Belge, Coordinator)
- Francesco Argenton (Italy)
- Helen Edlund (Sweden)
- Michael Walker (Israel)
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