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(Last
modification: 19. March 2009)
Acridonsynthase (ACS) in Ruta
graveolens
-> Link
zur Beschreibung der N-Methyltransferase (NMT), welche N-Methylanthranilat
synthetisiert. Obwohl es eine NMT ist: Das Protein gehört in die grosse Familie
der
O-Methyltransferasen (OMT)! Mehr...
->
Sehen Sie sich auch dies an: Ein ungewöhnliches Enzym aus
Huperzia serrata: Es hat auch ACS-Aktivität
in vitro!
Acridon-Alkaloide sind interessante Substanzen, nicht nur wegen ihrer
biologischen Aktivitäten, sondern auch wegen ihrer Biosynthese. Wenn Sie alles
über sie wissen und auf dem Laufenden bleiben wollen: Seit vielen Jahren gibt es
regelmässig Übersichtsartikel über die neuere Literatur (Michael, 1997; 1999;
2000; 2001; 2002; 2003; 2004; 2005; 2007).
Für den Zweck dieser Seite werde ich mich auf die Biosynthese
in der Weinraute (Ruta graveolens) beschränken, denn die meisten der
enzymatischen und molekularen Untersuchungen wurden an dieser Pflanze oder ihren
Zellkulturen durchgeführt. Wikipedia hat eine nette Übersicht über die Pflanze
und ihre Naturprodukte (englisch:
Common Rue ; deutsch:
Weinraute).
Aus der Struktur der Acridone ergab sich sehr früh die
Vermutung, dass das Grundgerüst durch eine Polyketidsynthase (PKS) gebildet
wird, ähnlich der Chalconsynthase (CHS), aber mit einem anderen
Starter-Substrat:
N-methylanthraniloyl-CoA.
Dies konnte dann auch in zellfreien Extrakten gezeigt werden (Baumert
et al., 1986; Baumert et al.,
1992), und die weitere Umwandlung des PKS Produktes zu Rutacridon, dem
Acridon-Alkaloid in R. graveolens, konnte auch demonstriert werden (Maier
et al., 1993). Das Schlüssel-Enzym, die Acridonsynthase (ACS), wurde dann
gereinigt, und Protein-Mikrosequenzierung ergab auch tatsächlich Peptide mit
deutlicher Ähnlichkeit zu den Chalconsynthasen, die zu der Zeit bekannt waren (Baumert et
al., 1994). Die Klonierung der cDNA wurde dann schon ein Jahr später
beschrieben, und die enzymatische Funktion wurde mit einem rekombinanten Protein
bestätigt (Junghanns
et al., 1995).
Die Grössenbestimmung des Proteins ergab eine Grösse,
die zu einem Monomer passte. Das war potentiell interessant, weil andere
Experimente mit CHS und Stilbensynthasen (STS) bereits zu der Zeit ganz klar
darauf hinwiesen, dass die Proteine dieser Superfamilie Homodimere (zwei
gleiche Untereinheiten) sind, und auch sein müssen (Tropf
et al., 1995). Spätere Experimente zeigten dann auch, dass die ACS
keine Ausnahme war (Lukacin
et al., 1999). Eine andere interessante Frage war, ob die ACS auch
CHS-Aktivität hatte, d.h. mit 4-Coumaroyl-CoA ein richtiges Chalcon
synthetisierte. Die ersten Daten beschrieben so etwas nicht, aber spätere
Experimente mit hochaktiven rekombinanten Proteinen zeigten ganz klar, dass die
ACS tatsächlich eine signifikante CHS Aktivität besass (immerhin etwa 12-16% der
Aktivität mit N-Methylanthraniloyl-CoA!)
(Springob et al., 2000).
Die Abbildung zeigt die Reaktion der ACS.
Reaktion der Acridonsynthase
(ACS), eine Typ III PKS aus Ruta
graveolens.
N-Methylanthraniloyltriacetsäure-Lacton ist ein Nebenprodukt: Drei
Kondensationen, aber keine CHS-Typ Ringfaltung. Es entspricht dem
CTAL Nebenprodukt in CHS-Reaktionen:
mehr....
Viel Zeit und Mühe wurde für Untersuchungen aufgewendet, welche
Aminosäuren für die funktionellen Unterschiede zwischen ACS und CHS
verantwortlich sind, d.h. die präferentielle oder ausschliessliche Verwendung
von N-Methylanthraniloyl-CoA or 4-Coumaroyl-CoA. In diesem Zusammenhang
ist es wichtig, dass ACS einige CHS-Aktivität hat (s. oben), während CHS keine
ACS-Aktivität hat, d.h. mit N-Methylanthraniloyl-CoA nichts anfangen
kann. Die Ergebnisse zeigten dann, dass es gar nicht schwierig war, die
CHS-Aktivität der ACS zu steigern: Drei Aminosäure-Austausche waren ausreichend,
die ACS in eine CHS umzuwandeln, die nur noch ein bisschen ACS-Aktivität hatte
(Ser132 zu Thr, Ala133 zu Ser, und Val265 zu Phe) (Lukacin
et al., 2001). Das Umgekehrte, also die Umwandlung einer CHS in eine
ACS, war nicht so einfach, und war letztlich erfolglos. Die Änderung der
gleichen drei Aminosäuren aus der CHS zum Typ ACS brachte überhaupt nichts, und
etliche andere Änderungen (abgeleitet aus Modellierungs-Versuchen) ergaben nur
eine Verschlechterung der CHS-Aktivität, ohne dass eine ACS-Aktivität erreicht
werden konnte (Lukacin
et al., 2005). Eine andere Arbeitsgruppe benutzte die CHS von Medicago
sativa für ähnliche Experimente. Sie leitete aus Modellierungs-Versuchen ab,
dass ganz andere Aminosäuren wichtig sein könnten, nämlich Phe215 und Phe265,
die am Eingang der Tasche mit dem aktiven Zentrum lokalisiert sind; die Idee
war, dass diese grossen Aminosäuren verhinderten, dass das Enzym N-Methylanthraniloyl-CoA
akzeptieren kann. Die Umwandlung von Phe215 in ein Serin ergab tatsächlich eine
Mutante, die vorzugsweise das N-Methylanthraniloyl-CoA verwendete und
damit auch drei Kondensations-Reaktionen durchführte (Jez
et al., 2002). Aber trotzdem war das Ergebnis nicht das erwartete Acridon:
Es war N-Methylanthraniloyltriacetsäure-Lacton, das Pyron-Typ Produkt in
solchen Fällen, wo die CHS-Typ Ringfaltung nicht durchgeführt wurde. Die Formel
ist oben in der Schemazeichnung.
Und jetzt, Anfang 2008, der Bericht über die Klonierung der
N-Methyltransferase
(NMT), welche
für die Synthese des N-methylierten Anthranilats verantwortlich ist:
Offensichtlich geschieht dies auf der Ebene der freien Säure, nicht mit
Anthraniloyl-CoA
(Rohde et al., 2008).
Das überraschendste Ergebnis ist aber: Das Protein hat keine sonderliche
Ähnlichkeit mit anderen NMTs, sondern gehört eindeutig in die grosse Familie der
Hydroxyl-OMTs! Dies ist erst das zweite Beispiel, dass diese Familie andere
Funktionen als Hydroxyl-OMTs enthält. Das erste war die S-Methyltransferase
aus Catharanthus roseus (mehr...),
und tatsächlich sitzen die beiden auf eng benachbarten Zweigen in einem
Verwandtschaftsbaum (mehr...):
Die SMT und die NMT Proteine sind 53% identisch!
Zum
Seitenanfang
CHS-Typ Ring-Faltung, aber andere Substrate
Zitate
-
Junghanns, K. T., Kneusel, R. E., Baumert, A.,
Maier, W., Gröger, D., Matern, U., 1995.
Molecular cloning and
recombinant expression of acridone synthase from elicited Ruta
graveolens L. cell suspension cultures. Plant Molecular Biology 27,
681-692.
Cell
suspension cultures of Ruta graveolens L. produce a variety of
acridone alkaloids, and the accumulation can be stimulated by the
addition of fun_gal elicitors. Acridone synthase, the enzyme catalyzing
the synthesis of 1,3-dihydroxy-N-methylacridone from N-methylanthraniloyl-CoA
and malonyl-CoA, had been isolated from these cells, and the partial
enzyme polypeptide sequence, elucidated from six tryptic fragments,
revealed homology to heterologous chalcone synthases. Poly(A)+ RNA was
isolated from Ruta cells that had been treated for 6 h with a crude cell
wall elicitor from Phytophthora megasperma f. sp. glycinea,
and a cDNA library was constructed in lambda-2AP. Clones harboring
acridone synthase cDNA were isolated from the library by screening with
a synthetic oligonucleotide probe complementary to a short stretch of
sequence of the enzyme peptide with negligible homology to chalcone
synthases. The identity of the clones was substantiated by DNA
sequencing and by recognition of five additional peptides, determined
previously from tryptic acridone synthase digests, in the translated
sequence. An insert of roughly 1.4 kb encoded the complete acridone
synthase, and alignments at both DNA and protein levels corroborated the
high degree of homology to chalcone synthases. Expression of the enzyme
in vector pET-11c in the Escherichia coli pLysS host strain proved the
identity of the cloned cDNA. The heterologous enzyme in the crude E.
coli extract exhibited high acridone but no chalcone synthase activity.
The results were fully supported by northern blot hybridizations which
revealed that the specific transcript abundance did not increase but
rather decreased upon white light irradiation of cultured Ruta
graveolens L. cells, a condition that commonly induces the abundance
of chalcone synthase transcripts.
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-
Lukacin, R., Springob, K., Urbanke, C., Ernwein,
C., Schröder, G., Schröder, J., Matern, U., 1999.
Native acridone
synthases I and II from Ruta graveolens L. form homodimers.
FEBS Letters 448, 135-140.
Acridone synthase II cDNA was cloned from irradiated cell
suspension cultures of Ruta graveolens L. and expressed in
Escherichia coli. The translated polypeptide of Mr
42681 revealed a high degree of similarity to heterologous chalcone and
stilbene synthases (70-75%), and the sequence was 94% identical to that of
acridone synthase I cloned previously from elicited Ruta cells.
Highly active recombinant acridone synthases I and II were purified to
apparent homogeneity by a four-step purification protocol, and the
affinities to N-methylanthraniloyl-CoA and malonyl-CoA were determined. The
molecular mass of acridone synthase II was estimated from size exclusion
chromatography on a Fractogel EMD BioSEC (S) column at about 45 kDa, as
compared to a mass of 44 +/- 3 kDa found for the acridone synthase I on
Superdex 75. Nevertheless, the sedimentation analysis by ultracentrifugation
revealed molecular masses of 81+/-4 kDa for both acridone synthases. It is
proposed, therefore, that the acridone synthases of Ruta
graveolens are typical homodimeric plant polyketide synthases.
Sonderdruckanfrage
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-
Rohde, B., Hans, J., Martens, S.,
Baumert, A., Hunziker, P., Matern, U., 2008.
Anthranilate N-methyltransferase, a branch-point enzyme of acridone
biosynthesis. Plant Journal 53, 541-553.
Acridone alkaloids formed by acridone synthase in Ruta graveolens
L. are composed of N-methylanthraniloyl CoA and malonyl CoAs. A 1095
bp cDNA from elicited Ruta cells was expressed in Escherichia coli,
and shown to encode S-adenosyl-L-methionine-dependent anthranilate N-methyltransferase.
SDS-PAGE of the purified enzyme revealed a mass of 40 +/- 2 kDa,
corresponding to 40 059 Da for the translated polypeptide, whereas the
catalytic activity was assigned to a homodimer. Alignments revealed closest
relationships to catechol or caffeate O-methyltransferases at 56%
and 55% identity (73% similarity), respectively, with little similarity (
approximately 20%) to N-methyltransferases for purines, putrescine,
glycine, or nicotinic acid substrates. Notably, a single Asn residue
replacing Glu that is conserved in caffeate O-methyltransferases
determines the catalytic efficiency. The recombinant enzyme showed narrow
specificity for anthranilate, and did not methylate catechol, salicylate,
caffeate, or 3- and 4-aminobenzoate. Moreover, anthraniloyl CoA was not
accepted. As Ruta graveolens acridone synthase also does not accept
anthraniloyl CoA as a starter substrate, the anthranilate N-methylation
prior to CoA activation is a key step in acridone alkaloid formation,
channelling anthranilate from primary into secondary branch pathways, and
holds promise for biotechnological applications. RT-PCR amplifications and
Western blotting revealed expression of the N-methyltransferase in
all organs of Ruta plants, particularly in the flower and root, mainly
associated with vascular tissues. This expression correlated with the
pattern reported previously for expression of acridone synthase and
acridone alkaloid accumulation.
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mehr...
-
Baumert, A., Maier, W., Gröger, D., Deutzmann,
R., 1994.
Purification and properties of acridone synthase from cell suspension
cultures of Ruta graveolens.
Zeitschrift für Naturforschung
49c, 26-32.
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-
Baumert, A., Porzel, A., Schmidt, J., Gröger, D.,
1992.
Formation of 1,3-dihydroxy-N-methylacridone from N-methylanthraniloyl-CoA
and malonyl-CoA by cell-free extracts of Ruta graveolens.
Zeitschrift für Naturforschung
47c, 365-368.
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-
Baumert, A., Schneider, G., Gröger, D., 1986.
Biosynthesis
of acridone alkaloids. A cell-free system from Ruta graveolens cell
suspension cultures.
Zeitschrift für Naturforschung 41c, 187-192.
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-
Jez, J. M., Bowman, M. E., Noel, J. P., 2002.
Expanding the
biosynthetic repertoire of plant type III polyketide synthases by altering
starter molecule specificity. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 99, 5319-5324.
Zurück zum Text
-
Lukacin, R., Schreiner, S., Matern, U., 2001.
Transformation of acridone synthase to chalcone synthase.
FEBS Letters 508, 413-417.
Zurück zum Text
-
Lukacin, R., Schreiner, S., Silber, K., Matern,
U., 2005.
Starter substrate specificities of wild-type and mutant polyketide
synthases from Rutaceae.
Phytochemistry 66, 277-284.
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-
Maier, W., Baumert, A., Schumann, B., Furukawa, H.,
Gröger, D., 1993.
Synthesis of
1,3-dihydroxy-N-methylacridone and its conversion to rutacridone by
cell-free extracts of Ruta graveolens cell cultures.
Phytochemistry 32, 691-698.
Zurück zum Text
-
Morita, H., Kondo, S., Kato, R., Wanibuchi, K.,
Noguchi, H., Sugio, S., Abe, I., Kohno, T., 2007. Crystallization and
preliminary crystallographic analysis of an acridone-producing novel
multifunctional type III polyketide synthase from Huperzia serrata.
Acta Crystallograph. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. F63, 576-578.
Zurück zum Text
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Springob, K., Lukacin, R., Ernwein, C., Gröning,
I., Matern, U., 2000. Specificities of functionally expressed chalcone and
acridone synthases from Ruta graveolens. European Journal of
Biochemistry 267, 6552-6559.
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-
Tropf, S., Kärcher, B., Schröder, G., Schröder, J.,
1995. Reaction mechanisms of homodimeric plant polyketide synthases
(stilbene and chalcone synthase): a single active site for the condensing
reaction is sufficient for synthesis of stilbenes, chalcones, and
6'-deoxychalcones.
Journal
of Biological Chemistry 270, 7922-7928.
Stilbene (STS) and chalcone (CHS) synthases are homodimeric,
related plant-specific polyketide synthases. Both perform a sequential
condensation of three acetate units to a starter residue to form a
tetraketide intermediate that is folded to the ring systems specific to the
different products. Protein cross-linking and site-directed mutagenesis
identified a subunit contact site in position 158, close to the active site
(Cys-169). This suggested that the active site pockets may be neighboring,
possibly alternating in the condensing reactions rather than acting
independently. This was investigated by coexpression of active site mutants
with differently mutated, inactive proteins. With both STS and CHS, the
heterodimers synthesized the end products, indicating that each subunit
performed all three condensations. In co-action with a monomeric reductase,
CHS also synthesizes 6'-deoxychalcone, but with the chalcone as second
product when using plant preparations. The two enzymes expressed as single
species in E. coli synthesized both products, and both were
also obtained with a CHS heterodimer containing a single active site. The
results showed that 6'-deoxychalcone synthesis required no other plant
factor and that the formation of two products may be an intrinsic property
of the interaction between dimeric CHS and monomeric reductase.
Sonderdruckanfrage
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Übersichtsartikel
-
Michael, J. P., 1997. Quinoline, quinazoline and acridone alkaloids.
Natural Product Reports 14, 11-20.
-
Michael, J. P., 1999. Quinoline, quinazoline and acridone alkaloids.
Natural Product Reports 16, 697-709.
-
Michael, J. P., 2000. Quinoline, quinazoline and acridone alkaloids.
Natural Product Reports 17, 603-620.
-
Michael, J. P., 2001. Quinoline, quinazoline and acridone alkaloids.
Natural Product Reports 18, 543-559.
-
Michael, J. P., 2002. Quinoline, quinazoline and acridone alkaloids.
Natural Product Reports 19, 742-760.
-
Michael, J. P., 2003. Quinoline, quinazoline and acridone alkaloids.
Natural Product Reports 20, 476-493.
-
Michael, J. P., 2004. Quinoline, quinazoline and acridone alkaloids.
Natural Product Reports 21, 650-668.
-
Michael, J. P., 2005. Quinoline, quinazoline and acridone alkaloids.
Natural Product Reports 22, 627-646.
-
Michael, J. P., 2007. Quinoline, quinazoline and acridone alkaloids.
Natural Product Reports 24, 223-246.
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