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(Last modification: 24. February 2010)

Sieben Kondensationsreaktionen:
Oktaketid-Synthase (OKS) in der Anthron-Biosynthese

(Abe et al., 2005, vorläufige Kristallstruktur: Morita et al., 2007)

     Dies war tatsächlich ziemlich unerwartet: Eine Chalconsynthase-verwandte PKS aus Pflanzen, die sieben Kondensationen durchführte! Das Protein aus einer Aloe (Aloe arborescens (Tintenfisch-Aloe) war 50-60% identisch mit anderen pflanzlichen Typ III PKS, aber zu 90% identisch mit der Pentaketid-Synthase aus der gleichen Pflanze. Das in E. coli exprimierte rekombinante Protein führte mit Malonyl-CoA als Startersubstrat sieben Kondensationen durch und bildete die aromatischen Oktaketide SEK4 und SEK4b; dies sind die längsten Polyketide, die von pflanzlichen Typ III PKS synthetisiert werden .
     Die Abbildung zeigt die in vitro Reaktionen und Produkte. Die Reaktion kann mit Malonyl-CoA oder Acetyl-CoA initiiert werden, obwohl Malonyl-CoA aktiver zu sein scheint. Die Produkte sind identisch mit  denen, die durch eine 'minimale PKS' (d.h. die einfachste Basis-Einheit) der komplexen Biosynthese-Maschinerie für die Bildung des dimeren Antibiotikums Actinorhodin aus dem Bakterium Streptomyces coelicolor synthetisiert werden (Carreras et al., 1996) (Anmerkung: Das Antibiotikum ist ein Dimer; die monomere Untereinheit wird über sieben Kondensationreaktionen gebildet). Aloen enthalten diese Substanzen nicht, aber Anthrone und Anthrachinone, die wahrscheinlich von Oktaketiden abgeleitet sind.  Man kann vermuten, dass die OKS in vivo in der Biosynthese dieser Naturstoffe aktiv ist, und die Abbildung zeigt ein Beispiel, welches in einer neueren Übersicht vorgeschlagen wurde  (Abe, 2006).
     Es sollte angemerkt werden, dass die Reaktions-Sequenz zum Anthron eine Reduktion enthalten muss, ganz ähnlich wie bei der Biosynthese von Plumbagin (-> Hexaketid-Synthase) und bei anderen Enzymen, die in diesem Zusammenhang dort zitiert werden (mehr...). Wie in diesen Fällen scheint es sehr wahrscheinlich, dass das Fehlen eines solchen Schrittes an einem bestimmten Intermediat einer der Hauptgründe dafür ist, dass man nicht das vorhergesagte Produkt erhielt.
 

     Wie die PCS (Pentaketid-Synthase) zeigte auch die OKS eine beträchtliche Substrat-Promiskuität.  Sie akzeptierte auch aromatische CoA-Ester (wie 4-Coumaroyl-CoA, Cinnamoyl-CoA, und Benzoyl-CoA) und lang-kettige aliphatische Fettsäure-CoA-Ester (wie Hexanoyl-CoA, Oktanoyl-CoA, Dekanoyl-CoA, Dodekanoyl-CoA, Tetradekanoyl-CoA, Hexadekanoyl-CoA, Octadekanoyl-CoA, und Eikosanoyl-CoA) als Starter, aber in allen Fällen wurden nur zwei (-> Triketide) oder drei (-> Tetraketide) Kondensationen durchgeführt, und als Produkte wurden die entsprechenden Pyrone freigesetzt.  Beispielhaft sollen hier nur die Produkte von 4-Coumaroyl-CoA genannt werden: Bisnoryangonin und CTAL (4-Coumaroyltriacetat), nach zwei und drei Kondensations-Reaktionen. 4-Coumaroyl-CoA ist das typische Substrat für Chalcon- und Stilben-Synthasen (CHS, STS), und Bisnoryangonin und CTAL sind typische Nebenprodukte dieser Enzyme. 
     Überraschenderweise können selbst typische CHS bis zu sieben Kondensationen mit untypischen Substraten durchführen, wenn sie in den richtigen Positionen mutagenisiert sind (Abe et al., 2006): Diese Arbeiten konnten zeigen, dass die Ser338->Val Mutante der Scutellaria baicalensis  CHS mit Malonyl-CoA die gleichen Oktaketide wie die OKS bildete (also SEK4/SEK4b). Diese Fähigkeit wurde noch dramatisch verstärkt, wenn zwei zusätzliche Mutationen eingeführt wurden: Thr197->Gly und Gly256->Leu. Es wird vermutet, dass diese dramatische Änderung der Funktion dadurch verursacht wurde, dass eine sterische Konfiguration der aktiven Tasche stark verändert wurde. Ein überzeugendes Beispiel dafür, wie schnell und mit wie wenigen Veränderungen neue Funktionen bei pflanzlichen Typ III PKS erzeugt werden können!

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Links zu den einzelnen Seiten: Enzyme mit mehr als drei Kondensationen

• Übersicht

• Vier Kondensationsreaktionen: Chromonsynthese in Aloe arborescens

• Vier Kondensationsreaktionen, Vorschlag: 4-Hydroxy-5-Methylcoumarin in Gerbera

• Fünf Kondensationsreaktionen: Plumbaginsynthese in Plumbago indica und Drosophyllum lusitanicum

• Sechs Kondensationsreaktionen: Aloesonsynthese in Rheum palmatum und Aloe arborescens

• Sieben Kondensationsreaktionen:
  - Diese Seite: Anthronsynthese in Aloe arborescens
  - Hypericinsynthese in Hypericum perforatum

• Funktionelle Interkonversion von PCS and OKS: Fünf  <--> Sieben Kondensationen

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Zitate

• Mizuuchi, Y., Shi, S.-P., Wanibuchi, K., Kojima, A., Morita, H., Noguchi, H., Abe, I., 2009. Novel type III polyketide synthases from Aloe arborescens. FEBS Journal 276, 2391-2401.
  Aloe arborescens is a medicinal plant rich in aromatic polyketides, such as pharmaceutically important aloenin (hexaketide), aloesin (heptaketide) and barbaloin (octaketide). Three novel type III polyketide synthases (PKS3, PKS4 and PKS5) were cloned and sequenced from the aloe plant by cDNA library screening. The enzymes share 85-96% amino acid sequence identity with the previously reported pentaketide chromone synthase and octaketide synthase. Recombinant PKS4 and PKS5 expressed in Escherichia coli were functionally identical to octaketide synthase, catalyzing the sequential condensations of eight molecules of malonyl-CoA to produce octaketides SEK4. SEK4b. As in the case of octaketide synthase, the enzymes are possibly involved in the biosynthesis of the octaketide barbaloin. On the other hand, PKS3 is a multifunctional enzyme that produces a heptaketide aloesone (i.e. the aglycone of aloesin) as a major product from seven molecules of malonyl-CoA. In addition, PKS3 also afforded a hexaketide pyrone (i.e. the precursor of aloenin), a heptaketide 6-(2-acetyl-3,5-dihydroxybenzyl)-4-hydroxy-2-pyrone, a novel heptaketide 6-(2-(2,4-dihydroxy-6-methylphenyl)-2-oxoethyl)-4-hydroxy-2-pyrone and octaketides SEK4/SEK4b. This is the first demonstration of the enzymatic formation of the precursors of the pharmaceutically important aloesin and aloenin by a wild-type PKS obtained from A. arborescens. Interestingly, the aloesone-forming activity was maximum at 50 degree C, and the novel heptaketide pyrone was non-enzymatically converted to aloesone. In PKS3, the active-site residue 207, which is crucial for controlling the polyketide chain length depending on the steric bulk of the side chain, is uniquely substituted with Ala. Site-directed mutagenesis demonstrated that the A207G mutant dominantly produced the octaketides SEK4 / SEK4b, whereas the A207M mutant yielded a pentaketide 5,7-dihydroxy-2-methylchromone.
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• Shi, S. P., Wanibuchi, K., Morita, H., Endo, K., Noguchi, H., Abe, I., 2009a. Enzymatic formation of unnatural novel chalcone, stilbene, and benzophenone scaffolds by plant type III polyketide synthase. Organic Letters 11, 551-554.
     A C(19) hexaketide stilbene and a C(21) heptaketide chalcone were synthesized by Aloe arborescens octaketide synthase (OKS), a plant-specific type III polyketide synthase (PKS). Remarkably, the C(21) chalcone-forming activity was dramatically increased in a structure-guided OKS N222G mutant that produces a C(20) decaketide SEK15 from 10 molecules of malonyl-CoA. The findings suggested further strategies for production of unnatural polyketides by combination of the precursor-directed biosynthesis and the structure-guided engineering of type III PKS.
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• Shi, S.-P., Morita, H., Wanibuchi, K., Noguchi, H., Abe, I., 2009b. Enzymatic formation of unnatural novel polyketide scaffolds by plant-specific type III polyketide synthase. Tetrahedron Letters 50, 2150-2153.
  The catalytic potential of octaketide synthase (OKS), a plant-specific type III polyketide synthase (PKS) from Aloe arborescens, was investigated by phenylacetyl-CoA and benzoyl-CoA as starter substrates. As a result, a novel C16 pentaketide coumarin was produced from phenylacetyl-CoA, whereas benzoyl-CoA was not a good substrate of OKS. Remarkably, a structure-guided OKS N222G mutant dramatically extended the product chain length to yield four novel polyketides including C22 aromatic octaketides from the C6-C2 phenylacetyl starter, as well as a novel C19 heptaketide benzophenone from the C6-C1 benzoyl starter.
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• Abe, I., Oguro, S., Utsumi, Y., Sano, Y., Noguchi, H., 2005. Engineered biosynthesis of plant polyketides: chain length control in an octaketide-producing plant type III polyketide synthase. Journal of the American Chemical Society 127, 12709-12716.
     The chalcone synthase (CHS) superfamily of type III polyketide synthases (PKSs) produces a variety of plant secondary metabolites with remarkable structural diversity and biological activities (e.g., chalcones, stilbenes, benzophenones, acrydones, phloroglucinols, resorcinols, pyrones, and chromones). Here we describe an octaketide-producing novel plant-specific type III PKS from aloe (Aloe arborescens) sharing 50-60% amino acid sequence identity with other plant CHS-superfamily enzymes. A recombinant enzyme expressed in Escherichia coli catalyzed seven successive decarboxylative condensations of malonyl-CoA to yield aromatic octaketides SEK4 and SEK4b, the longest polyketides known to be synthesized by the structurally simple type III PKS. Surprisingly, site-directed mutagenesis revealed that a single residue Gly207 (corresponding to the CHS's active site Thr197) determines the polyketide chain length and product specificity. Small-to-large substitutions (G207A, G207T, G207M, G207L, G207F, and G207W) resulted in loss of the octaketide-forming activity and concomitant formation of shorter chain length polyketides (from triketide to heptaketide) including a pentaketide chromone, 2,7-dihydroxy-5-methylchromone, and a hexaketide pyrone, 6-(2,4-dihydroxy-6-methylphenyl)-4-hydroxy-2-pyrone, depending on the size of the side chain. Notably, the functional diversity of the type III PKS was shown to evolve from simple steric modulation of the chemically inert single residue lining the active-site cavity accompanied by conservation of the Cys-His-Asn catalytic triad. This provided novel strategies for the engineered biosynthesis of pharmaceutically important plant polyketides.
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• Abe, I., Watanabe, T., Morita, H., Kohno, T., Noguchi, H., 2006. Engineered biosynthesis of plant polyketides: manipulation of chalcone synthase. Organic Letters 8, 499-502.
     Chalcone synthase (CHS) is a plant-specific type III polyketide synthase catalyzing condensation of 4-coumaroyl-CoA with three molecules malonyl-CoA. Surprisingly, it was demonstrated that S338V mutant of Scutellaria baicalensis CHS produced octaketides SEK4/SEK4b from eight molecules of malonyl-CoA. Further, the octaketides-forming activity was dramatically increased in a CHS triple mutant (T197G/G256L/S338T). The functional conversion is based on the simple steric modulation of a chemically inert residue lining the active-site cavity.
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• Abe, I., 2006. Engineered biosynthesis of plant polyketides. Chain length control in novel type III polyketide synthases. In: ACS Symposium Series #955, Polyketide: Synthesis, Biological Activity, and Genetic Engineering, American Chemical Society, pp. 109-127.
     A growing number of functionally divergent type III polyketide synthases (PKSs), the chalcone synthase (CHS) superfamily enzymes, have been cloned and characterized, which include recently obtained pentaketide chromone synthase (PCS) and octaketide synthase (OKS) from aloe (Aloe arborescens). Recombinant PCS expressed in Escherichia coli catalyzed successive condensations of malonyl-CoA to produce a pentaketide, 5,7-dihydroxy-2-methylchromone, while recombinant OKS yielded octaketides, SEK4 and SEK4b, the longest polyketides produced by the structurally simple type III PKS. PCS and OKS share 92% amino acid sequence identity, and maintain the conserved Cys-His-Asn catalytic triad. The most characteristic feature is that the CHS active site residue 197 (numbering in Medicago sativa CHS) is uniquely replaced with Met in PCS and Gly in OKS, respectively. Site-directed mutagenesis revealed that the chemically inert single residue 197 lining the active-site cavity determines the polyketide chain length and the product specificity depending on the size of the side chain.
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• Carreras, C. W., Pieper, R., Khosla, C., 1996. Efficient synthesis of aromatic polyketides in vitro by the actinorhodin polyketide synthase. Journal of the American Chemical Society 118, 5158-5159
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• Morita, H., Kondo, S., Kato, R., Wanibuchi, K., Noguchi, H., Sugio, S., Abe, I., Kohno, T., 2007. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of an octaketide-producing plant type III polyketide synthase. Acta Crystallograph. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. F63, 947-949.
     Octaketide synthase (OKS) from Aloe arborescens is a plant-specific type III polyketide synthase that produces SEK4 and SEK4b from eight molecules of malonyl-CoA. Recombinant OKS expressed in Escherichia coli was crystallized by the hanging-drop vapour-diffusion method. The crystals belonged to space group I422, with unit-cell parameters a = b = 110.2, c = 281.4 A ¢ª , alpha = beta = gamma = 90.0. Diffraction data were collected to 2.6 A ¢ª resolution using synchrotron radiation at BL24XU of SPring-8.
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File History:

• 24.02.2010: Update on literature: Mizuuchi et al., 2009

• 01.06.2009: Update of literature: Shi et al., 2009b

• 14.03.2009: Figures update

• 26.02.2009: Addition of new results: Shi et al., 2009a

• 26.01.2009: Update of reaction scheme

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