(Last
modification: 27.March 2009) Eine Kondensation: Benzalaceton
See unten: Microbielle Produktion von "natürlichem"
Himbeerketon: Mehr...
Himbeere (Rubus idaeus) Das charakteristische Aroma von Himbeeren
(Bild von Früchten) beruht auf 4-Hydroxyphenylbutan-2-one (pHPB, "raspberry ketone, Himbeer-Keton") (Larsen et al., 1991), und diese Substanz oder seine Glykoside (Pabst et al., 1990) wurden auch in anderen Pflanzen gefunden (Vorkommen: Zitate), z.B. in Pinus contorta (Bauer et al., 1955; Higuchi and Donnelly, 1977), Rhizoma rhei (Murakami and Tanaka, 1972), Vaccinium oxycoccus (European cranberries) (Hirvi et al., 1981), Hippophae rhamnoides (sea buckthorn) (Hirvi and Honkanen, 1984), Rheum palmatum (Nonaka et al., 1981; Nonaka and Nishioka, 1983), und Scutellaria rivularis (Lin and Chou, 1985). Diese Liste ist sicherlich nicht vollständig, aber sie gibt wenigstens eine Vorstellung davon, dass dies nicht extrem seltene Naturprodukte sind. Die Biosynthese von Himbeer-Keton 'Raspberry ketone' (siehe unten) benötigt zwei Aktivitäten (Enzyme: Zitate); diese wurden an Himbeer-Früchten und Gewebekulturen untersucht (Borejsza-Wysocki and Hrazdina, 1994). Das erste Enzym, Benzalacetonsynthase (BAS) (Borejsza-Wysocki and Hrazdina, 1996), verwendet einen Phenylpropanoid-Starter CoA-Ester, führt eine einzige Kondensationsreaktion mit Malonyl-CoA durch, und setzt ein dekarboxyliertes Produkt frei, wie unten gezeigt. Das zweite Enzym reduziert die Doppelbindung der Seitenkette mit NADPH, und bildet damit die Aroma-Komponente.
Die Reinigung der BAS war nicht völlig erfolgreich; es gelang nicht, die BAS- völlig von der CHS-Aktivität zu trennen. Dies war nicht so gut, denn frühere Experimente hatten gezeigt, dass gereinigte CHS durchaus Benzalaceton als Nebenprodukt bilden kann (Hrazdina et al., 1976; Saleh et al., 1978,
mehr...). So konnte damals nicht zwischen zwei Möglichkeiten unterschieden werden: Zwei verschiedene Proteine oder ein bifunktionales Enzym (Borejsza-Wysocki and Hrazdina, 1996). Für ein schönes Bild von Himbeeren und Links zu allgemeinen Informationen: Hier klicken.
Fig. 1
 Der erste Versuch zur Klonierung der BAS aus der Himbeere führte zu der Identifizierung von Genen für drei Typ III PKS (Zheng et al., 2001), aber leider war keines davon ein Gen für eine BAS: RiPKS1 war eine typische CHS; RiPKS2 hatte überhaupt keine detektierbare Aktivität mit irgendeinem der untersuchten Substrate, und RiPKS3 war eine CTAS (d.h. es führte drei Kondensationsreaktionen durch, aber nicht die Faltung zum Chalkon, wie auf einer anderen unserer Webseiten diskutiert: mehr...). Es ist unklar ob und welche Rolle dieses Enzym in der Pflanze hat. Neuere Arbeiten (Hrazdina and Zheng, 2006; Zheng and Hrazdina, 2008) berichten jetzt, dass zwei zusätzliche Gene charakterisiert werden konnten: RiPKS5 war nochmal eine CHS, aber RiPKS4 (85% Identität mit den anderen RiPKS) hatte interessante Eigenschaften:
RiPKS4 hatte sowohl BAS als auch CHS-Aktivität, war also ein bifunktionelles Enzym. Die Reaktionen werden in Fig. 2 gezeigt.
Fig. 2
 Interessanterweise war das Verhältnis zwischen den beiden Produkten substratabhängig. Feruloyl-CoA war nicht nur das beste Substrat, sondern auch dasjenige mit dem besten Verhältnis zwischen den Produkten aus einer und drei Kondensationsreaktionen (s. die Tabelle unten). Die Bedeutung ist nicht so klar, denn die Produkte von Feruloyl-CoA (oder von den anderen Startern mit 'gutem' Verhältnis zwischen BAS- und CHS-Aktivitäten) sind aus der Himbeere nicht bekannt. Verhältnisse der Produkte von RiPKS4 mit verschiedenen Substraten
 |
R1 |
R2 |
R3 |
Verhältnis *)
BAS : CHS |
Cinnamoyl-CoA |
-H |
-H |
-H |
0.5 |
4-Coumaroyl-CoA |
-H |
-OH |
-H |
0.4 |
Caffeoyl-CoA |
-OH |
-OH |
-H |
1.4 |
Feruloyl-CoA |
-OCH3 |
-OH |
-H |
16.7 |
5-Hydroxyferuloyl-CoA |
-OCH3 |
-OH |
-OH |
5.7 |
Sinapoyl-CoA |
-OCH3 |
-OH |
-OCH3 |
3.1 |
*) Verhältnis der Produkte mit 1 (BAS) und 3 Kondensationen (CHS)
Was war nun der Unterschied zwischen RiPKS4 und den anderen Himbeer-PKS, und war es möglich, seine einzigartigen Eigenschaften mit bestimmten Sequenz-Motiven zu korrelieren? Dies war wieder eine Überraschung. Der grösste Teil des Proteins sah genauso aus wie eine typische CHS. Okay, es gab da etliche Unterschiede zu den anderen Himbeer-PKS, aber alle in Positionen, die in CHS nicht sonderlich konserviert waren. Der wirklich auffällige Unterschied war am C-terminalen Ende des Proteins: die letzten 23 Aminosäuren waren offensichtlich ganz anders also sonst von CHS bekannt. Die divergente DNA-Sequenz begann nahe an einer EcoRI-Stelle, und das Ganze sah gerade so aus wie eine DNA-Rekombination, die zu einer höchst ungewöhnlichen Variation des Proteins am C-Terminus führte. Waren von dieser Divergenz Motive betroffen, die bekannterweise eine Funktion haben? Ja, tatsächlich. In Standard-CHS enthält diese Region ein 'FGFGPG'-Motif, welches ziemlich stark konserviert ist, und es wurde schon vorgeschlagen, dass es funktionell wichtig ist (Suh et al., 2000). Dieses Motif fehlt völlig in RiPKS4. Im Nachhinein: Diese Region, gerade weil sie so konserviert ist, wurde von uns und anderen zum Entwurf degenerierter Oligos benutzt, um damit nach neuen Mitgliedern der Typ III PKS Familie zu suchen: Offensichtlich hätte man damit wohl kaum RiPKS4 finden können !
Natürlich wird es notwendig sein, die Bedeutung dieser Divergenz für die BAS-Reaktion zu überprüfen, z.B. durch Austausch gegen eine 'CHS-typische' Sequenz. Trotzdem kann man wohl schon jetzt feststellen, das die BAS-Funktionalität auf verschiedenen Strategien basieren kann: Die BAS von Himbeere und die von Rheum palmatum haben keine erkennbaren gemeinsamen Sequenzelemente, die spezifisch oder einzigartig für die BAS-Funktion sein könnten. Dies erinnert an die Unterschiede zwischen CHS und Stilbensynthasen (STS): Auch hier gibt es keine Motive, die spezifisch für STS sind, und offensichtlich gibt es verschiedene Mechanismen, um die STS-typische Ringfaltung zu erreichen. Könnte RiPKS4 in vivo die langgesuchte BAS sein? Die notorische Substratpromiskuität und die Tendenz zu Nebenprodukt-Bildungen mahnen ganz klar zur Vorsicht, wenn es darum geht, physiologische Rollen aus in vitro Ergebnissen abzuleiten (mehr...), und offensichtlich sind weitere und andere Experimente notwendig. Trotzdem denke ich, dass es so sein könnte. Die CHS-Aktivität in vitro ist nicht notwendigerweise ein Argument dagegen: die einzige andere molekular charakterisierte BAS (aus Rheum palmatum) führte in vitro unter bestimmten Bedingungen auch mehr als eine Kondensation durch, z.B. wenn der pH im Testansatz leicht sauer war (pH 6.0, s. unten). Und auch in diesem Fall gibt es meines Wissens keine 'harte' Evidenz, dass das Protein in vivo eine BAS-Funktion hat. Zur Zeit scheint überhaupt nicht ausgeschlossen, dass ein bifunktionales Enzym in der Himbeere sowohl die Biosynthese des Himbeerketons bedient als auch die Anthocyanbiosynthese (CHS-Funktion); dies wurde sogar kürzlich vorgeschlagen (Beekwilder et al., 2007; siehe eine detailliertere Besprechung dieser Publikation unten in Kapitel 3).
Und da gibt es noch einen interessanten Punkt. Wie schon oben erwähnt, berichtete die Arbeitsgruppe von G. Hrazdina bereits vor mehr als 10 Jahren über die Reinigung der BAS aus Pflanzengewebe (Borejsza-Wysocki and Hrazdina, 1996). Eines der frustrierendsten Ergebnisse damals war, dass es nicht möglich war, BAS- und CHS-Aktivität voneinander zu trennen. Tatsächlich hatte das Enzym in der gereinigten Proteinfraktion in vielen Punkten ganz ähnliche Eigenschaften wie die rekombinante RiPKS4: Es sieht beinah so aus, als ob damals das gereinigte Protein im wesentlichen aus RiPKS4 bestand! Und dann wäre es natürlich unmöglich, die beiden Aktivitäten von einander zu trennen. Zum
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Mikrobielle Produktion von 'natürlichem' Himbeerketon (raspberry ketone) Denken Sie vielleicht, dass Himbeerketon ökonomisch keine Rolle spielt? Sie sollten noch mal darüber nachdenken, wie kürzlich in einer Publikation beschrieben (Beekwilder et al., 2007). Offensichtlich kann die Substanz in Aroma-Formulierungen für viele Pflanzen verwendet werden, z.B. Erdbeere, Kiwi, Kirsche, Aprikose, Weinbeeren, Äpfel, usw. Woher soll man es bekommen? Seine Synthese ist nicht schwierig, aber die Gesetze für Nahrungsmittel erlauben nicht, dass es als 'natürliches' Aroma vermarktet wird. Und wenn Sie auf die 'Mengen' in Pflanzen spekulieren: sie sind so niedrig, dass der Preis bis zu 20 Dollar per Gramm ist! Für die riesigen in der 'Softdrink-Industrie' benötigten Mengen ist das viel zu teuer.
Die hier zitierte Untersuchung (Beekwilder et al., 2007) sah sich deshalb nach anderen Möglichkeiten um: Die Produktion durch mikrobielle Fermentation, z.B. in E. coli oder Hefe. Zur Zeit dieser Experimente konnten die Autoren noch nichts über kürzlich beschriebene Himbeer-Gen für BAS wissen (s. oben, Zheng and Hrazdina, 2008), und deshalb nahmen sie eine nachgewiesene CHS aus der Himbeere (RiPKS6, Kumar and Ellis, 2003). Offensichtlich konnte dies nicht ideal sein, und deshalb mutierten sie die Himbeer-CHS in Richtung Rhabarber-BAS, in zwei Positionen: Leu214->Ile and Phe215->Leu; von diesen Aminosäuren wurde zu der Zeit vermutet, dass sie mit der Durchführung nur einer Kondensation zu tun haben (s. oben, Abe et al., 2003). Beide Enzyme wurden in vitro nach rekombinanter Expression getestet. Wie erwartet synthetisierte die CHS das Chalcon, aber die Mutante war eine Enttäuschung: Sie machte zwar kein Chalkon mehr, aber auch kaum Benzalaceton; die geringe Aktivität war kaum reproduzierbar.
Die Autoren machten sich dann an in vivo Untersuchungen, in der Hoffnung, dass sich die Mutante unter solchen Bedingungen besser benehmen würde. Im Zuge damit entwarfen sie auch ein richtiges Produktions-System: Fütterung von 4-Coumarat (offensichtlich notwendig, da E. coli oder Hefe keine Phenylpropanoide synthetisieren), und sie führten zusätzlich eine 4-Coumarat-CoA-Ligase ein (das 4Cl-2 Gen aus Tabak), für die Synthese des CoA-Esters, der als Starter für die PKS Reaktion essentiell ist. Weitere Experimente zeigten, dass die Einführung einer Reduktase (Bildung des Himbeerketons aus dem Benzalaceton) nicht nötig war: Die Bakterien und auch die Hefe hatten bereits solche Aktivitäten.
Die Untersuchungen mit der Mutante waren wieder ein bisschen enttäuschend: Es wurde ein bisschen Himbeerketon gemacht, aber viel zu wenig. Ein wenig unerwartet waren die Ergebnisse mit der CHS: Sie produzierte nicht nur Naringenin, sondern auch signifikante Mengen Himbeerketon in vivo. Praktisch die gleichen Resultate ergaben sich nach Expression in Hefe. Tatsächlich zeigten dann weitere Experimente mit anderen Typ III PKS (z.B. der CHS aus der Petunie, und sogar mit der STS aus der Weinrebe), dass diese Proteine auch etwas Himbeerketon in vivo produzierten.
Alles in allem ganz interessant, und möglicherweise brauchbar in der Produktion des Aroma-Stoffes, unter Vermeidung des Stigmas 'chemische Synthese' (wäre das Produkt der mikrobiellen Fermentation tatsächlich 'natürliches Aroma'?). Generell, wenn man sich das so ansieht, was CHS und STS so an Nebenprodukten bilden können (mehr...): Dies sieht gerade so aus wie die Ergebnisse aus vielen in vitro Experimenten, auch wenn man wohl nicht so ohne weiteres erwartet hätte, das in vivo Bedingungen so drastisch dazu führen können, dass die Anzahl der Kondensationen von drei (CHS) auf eins (BAS) reduziert wird. Es wäre interessant, ob ein solches System nach einigen Verbesserungen (z.B. Verwendung einer 'echten' BAS) wirklich brauchbar ist für die Produktion von 'natürlichem' Himbeerketon. Zum
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Zitate Vorkommen von Benzalaceton und Derivaten Bauer, L., Birch, A. J., Ryan, A. J., 1955. Studies in relation to biosynthesis. VI. Rheosmin. Australian Journal of Chemistry 8, 534-538. Higuchi, R., Donnelly, D. M. X., 1977. Glycosides from Pinus contorta. Phytochemistry 16, 1587-1590. Hirvi, T., Honkanen, E., 1984. The aroma of the fruit of sea buckthorn. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchungsforschung 179, 387-388. Hirvi, T., Honkanen, E., Pyysalo, T., 1981. The aroma of cranberries. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchungsforschung 172, 365-367. Larsen, M., Poll, L., Callesen, O., Lewis, M., 1991. Relations between the aroma compounds and the sensory evaluation of 10 raspberry varieties (Rubus idaeus) L. Acta Agriculture Scandinavia 41, 447-454. Lin, Y. L., Chou, C. J., 1985. Studies on the constituents of aerial parts of Scutellaria rivularis wall. Chemical Abstracts 102, 92951. Murakami, T., Tanaka, K., 1972. Neue phenolische Glykoside in Rhizoma rhei. Tetrahedron Letters 29, 2965-2968. Nonaka, G., Nishioka, I., 1983. Tannins and related compounds. X. Rhubarb (2). Chemical & Pharmaceutical Bulletin 31, 1652-1658. Nonaka, G., Nishioka, I., Nagasawa, T., Oura, H., 1981. Tannins and related compounds. I. Rhubarb (1). Chemical & Pharmaceutical Bulletin 29, 2862-2870. Pabst, A., Barron, D., Adda, J., Schreier, P., 1990. Phenylbutan-2-one ß-D-glucosides from raspberry fruit. Phytochemistry 29, 3853-3858.
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Enzymologie
und Molekularbiologie -
Zheng, D., Hrazdina, G., 2008.
Molecular and biochemical characterization of benzalacetone synthase and chalcone synthase genes and their proteins from raspberry (Rubus idaeus L). Archives of Biochemistry and Biophysics 470,
139-145.
Two new members of the polyketide synthase (PKS) gene family (RiPKS4 and RiPKS5) were cloned from raspberry fruits (Rubus idaeus L., cv Royalty) and expressed in E. coli. Characterization of the recombinant enzyme products indicated that RiPKS4 is a bifunctional polyketide synthase producing both 4-hydroxybenzalacetone and naringenin chalcone. The recombinant RiPKS4 protein, like the native protein from raspberry fruits accepted p-coumaryl-CoA and ferulyl-CoA as starter substrates and catalyzed the formation of both naringenin chalcone, 4-hydroxy-benzalacetone and 3-methoxy-4-hydroxy-benzalacetone. Although activity of RiPKS4 was higher with ferulyl-CoA than with p-coumaryl-CoA, the corresponding product, 3-methoxy-4-hydroxy phenylbutanone could not be detected in raspberries to date. Sequence analysis of the genes and proteins suggested that this feature of RiPKS4 was created by variation in the C-terminus due to DNA recombination at the 3'region of its coding sequence. RiPKS5 is a typical chalcone synthase (CHS) that uses p-coumaryl-CoA only as starter substrate and produces naringenin chalcone exclusively as the reaction product.
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Hrazdina, G., Zheng, D., 2006.
Expression and function of aromatic polyketide synthase genes in raspberries (Rubus idaeus sp.). In: Rimando, A. M., Baerson, S. R. (Eds.), Polyketides: Biosynthesis, Biological Activities and Genetic Engineering, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 128-140.
The genus Rubus
contains a family of type III polyketide synthases which show differences in
structure and function. We have cloned and characterized five aromatic
polyketide synthase genes from raspberries. All five genes contain an intron
of varying length and have 1173 bp coding sequences, with the exception of
one gene that consists of 1149 bp. Four of the five genes encode proteins
with 391 amino acid residues with a calculated protein mass of 42 kDa, while
one gene coded for a shorter protein consisting of 383 amino acids. Sequence
comparison of the five polyketide synthase genes showed high similarity both
at the DNA and protein levels. Differences in the coding region were found
mainly in the flanking sequences. Analysis of the reaction products showed
that PKS1 and PKS5 were chalcone synthases, PKS2 that differs in six amino
acids from PKS1 is silent, PKS3 is a p-coumarate triacetic acid
lactone synthase (CTAS) and PKS4 is a benzalacetone synthase (BAS). The
structural variations and the architecture of these PKS genes and enzymes is
discussed.
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Zheng, D., Schröder, G., Schröder, J., and Hrazdina, G., 2001. Molecular and biochemical characterization of three aromatic polyketide synthase genes from Rubus idaeus. Plant Molecular Biology 46, 1-15.
Three polyketide synthase (PKS) genes from cell suspension cultures of raspberry (Rubus idaeus L. cv Royalty) were characterized. They showed high similarity in both their nucleotide and deduced amino acid sequences. All three proteins contain the amino acid residues identified in previous work as essential for chalcone synthase (CHS) function. Enzyme activities were investigated after heterologous expression in E. coli. RiPKS1 is a typical naringenin CHS that synthesizes the chalcone as the main reaction product, and p-coumaryltriacetic acid lactone (CTAL) as a minor by-product. RiPKS3 differed from RiPKS1 in four positions (K49R, M64R, P120L, V188A), and the products in vitro were predominantly CTAL and low amounts of chalcone. RiPKS2 had the same four differences to RiPKS1 as RiPKS3, but in addition two further exchanges (R259H, F344L), and the protein had no detectable enzyme activity. Experiments with RiPKS1 containing either 259H or 344L showed that each of the exchanges was sufficient to completely eliminate enzyme activity. These experiments identify amino acid residues in CHS which are important for folding of the tetraketide intermediate to the chalcone (PKS3) and which are in general essential for CHS activity (PKS2). The possible functions of these residues are discussed.
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Borejsza-Wysocki, W., Hrazdina, G., 1994. Biosynthesis of p-hydroxyphenylbutan-2-one in raspberry fruits and tissue cultures. Phytochemistry 35, 623-628.
p-Hydroxyphenylbutan-2-one (pHPB), the raspberry ketone, is responsible for the
characteristic aroma of raspberries. The compound accumulates rapidly during the
later maturation stages of the berries. The synthesis and accumulation of pHPB
correlates with that of anthocyanin and soluble solids ( degree Brix). pHPB is
synthesized in cell-free extracts of fruits and tissue cultures from
p-coumaryl-CoA and malonyl-CoA in a manner similar to the synthesis of chalcones
and stilbenes. The specific biosynthetic pathway for pHPB formation deviates
from the general phenylpropanoid pathway at the p-coumaryl-CoA stage and it is
composed of two enzymes. The first enzyme is the p-hydroxyphenylbut-3-ene-2-one
synthase (pHPB-3-ene-2-one synthase) that forms p-hydroxyphenylbut-3-ene-2-one
by the condensation of malonyl-CoA with p-coumaryl-CoA. The second enzyme, p-
hydroxyphenylbut-3-ene-2-one reductase (pHPB-3-ene-2-one reductase), reduces the
p-hydroxyphenylbut-3-ene-2-one to p-hydroxyphenylbutan-2-one, the raspberry
ketone. We detected the activity of both enzymes in crude extracts from
raspberry fruits and their tissue cultures, and identified their reaction
products by HPLC, crystallization to constant radioactivity and by GC-MS.
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Borejsza-Wysocki, W., Hrazdina, G., 1996. Aromatic polyketide synthases (Purification, characterization, and antibody development to benzalacetone synthase from raspberry fruits). Plant Physiology 110, 791-799.
p-Hydroxyphenylbutan-2-one, the characteristic aroma compound of raspberries (Rubus
idaeus L.), is synthesized from pcoumaryl-coenzyme A and malonyl-coenzyme A
in a two-step reaction sequence that is catalyzed by benzalacetone synthase and
benzalacetone reductase (W. Borejsza-Wysocki and G. Hrazdina (1994,
Phytochemistry 35: 623-628). Benzalacetone synthase condenses one malonate with
p-coumarate to form the pathway intermediate p- hydroxyphenylbut-3-ene-2-one (p-hydroxybenzalacetone)
in a reaction that is similar to those catalyzed by chalcone and stilbene
synth_ases. We have obtained an enzyme preparation from ripe raspberries that
was preferentially enriched in benzalacetone synthase (approximately 170-fold)
over chalcone synthase (approximately 14-fold) activity. This preparation was
used to characterize benzalacetone synthase and to develop polyclonal antibodies
in rabbits. Benzalacetone synthase showed similarity in its molecular properties
to chalcone synthase but differed distinctly in its substrate specificity,
response to 2-mercaptoethanol and ethylene glycol, and induction in cell-
suspension cultures. The product of the enzyme, p-hydroxybenzalacetone,
inhibited mycelial growth of the raspberry pathogen Phytophthora fragariae var
rubi at 250 mu-M. We do not know whether the dual activity in the benzalacetone
synthase preparation is the result of a bifunctional enzyme or is caused by
contamination with chalcone synthase that was also present. The rapid induction
of the enzyme in cell-suspension cultures upon addition of yeast extract and the
toxicity of its product, p- hydroxybenzalacetone, to phytopathogenic fungi also
suggest that the pathway may be part of a plant defense response.
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Hrazdina, G., Kreuzaler, F., Hahlbrock, K., Grisebach, H., 1976.
Substrate specificity of flavanone synthase from cell suspension cultures of parsley and structure of release products in vitro. Archives of Biochemistry and Biophysics 175, 392-399.
The
substrate specificity of an extensively purified flavanone synthase from
light-induced cell suspension cultures of Petroselinum hortense was
investigated. p-Coumaroyl-CoA was found to be the only efficient substrate for
flavanone synthesis, producing naringenin (5,7,4'-trihydroxyflavanone). Besides
4-hydroxy-6[4-hydroxystyryl]2-pyrone (F. Kreuzaler and K. Hahlbrock (1975) Arch.
Biochem. Biophys. 169, 84-90) two further release products of the synthase
reaction in vitro were identified as
4-hydroxy-5,6-dihydro-6(4-hydroxyphenyl)2-pyrone and p-hydroxybenzalacetone. The
apparent Km values for malonyl-CoA and p-coumaroyl-CoA in the reaction leading
to naringenin, and for p-coumaroyl-CoA in the reaction leading to the
styrylpyrone derivative were 35, 1.6, and 2.6 µM, respectively. With
caffeoyl-CoA as substrate only a very small amount of eriodictyol
(5,7,3',4'-tetrahydroxyflavanone) was formed besides relatively large amounts of
the corresponding styrylpyrone, dihydropyrone, and benzalacetone derivatives. No
flavanone formation was observed with feruloyl-CoA as substrate, but again
appreciable amounts of the three types of short-chain release products were
formed. No reaction at all took place with cinnamoyl-CoA, p-methoxycinnamoyl-CoA,
isoferuloyl-CoA, or p-hydroxybenzoyl-CoA. None of the styrylpyrone,
dihydropyrone, and benzalacetone derivatives has been detected in the cell
cultures in vivo. The present results suggest that naringenin is the only
natural product of the synthase reaction and that further substitution in the
B-ring of the flavonoids occurs in parsley at or after the flavanone stage. The
nature of the smaller release products is consistent with the assumption of a
stepwise addition of acetate units from malonyl-CoA to the acyl moiety of the
starter molecule, p-coumaroyl-CoA.
Note: at the time of this publication the chalcone synthase (CHS)
was labelled as flavanone synthase; this was corrected later:
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Saleh, N. A. M., Fritsch, H., Kreuzaler, F., Grisebach, H., 1978.
Flavanone synthase from cell suspension cultures of Haplopappus gracilis and comparison with the synthase from parsley. Phytochemistry 17, 183-186.
Flavanone synthase was
isolated and purified ca 62-fold from cell suspension cultures of Haplopappus
gracilis. The enzyme preparation catalysed the formation of naringenin from
4-coumaryl-CoA and malonyl-CoA with a pH optimum of ca. 8. The same enzyme was
also capable of synthesizing eriodictyol from caffeyl-CoA and malonyl-CoA; in
this case the pH optimum lay between 6.5 and 7. The homogeneous flavanone
synthase from cell suspension cultures of parsley showed the same dependence of
the pH optimum on the nature of the cinnamyl-CoA. It can be concluded that both
naringenin and eriodictyol are natural products of the synthase reaction.
Note: at the time of this publication the chalcone synthase (CHS)
was labelled as flavanone synthase; this was corrected later:
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Beekwilder, J., Van der Meer, I. M., Sibbesen, O., Broekgaarden, M., Qvist, I., Mikkelsen, J. D., Hall, R. D., 2007.
Microbial production of natural raspberry ketone. Biotechnology Journal 2, 1270-1279.
Raspberry ketone is
an important compound for the flavour industry. It is frequently used in
products such as soft drinks, sweets, puddings and ice creams. The compound
can be produced by organic synthesis. Demand for "natural" raspberry ketone
is growing considerably. However, this product is extremely expensive.
Consequently, there is a remaining desire to better understand how raspberry
ketone is synthesized in vivo, and which genes and enzymes are
involved. With this information we will then be in a better position to
design alternative production strategies such as microbial fermentation.
This article focuses on the identification and application of genes
potentially linked to raspberry ketone synthesis. We have isolated candidate
genes from both raspberry and other plants, and these have been introduced
into bacterial and yeast expression systems. Conditions have been determined
that result in significant levels of raspberry ketone, up to 5 mg/L. These
results therefore lay a strong foundation for a potentially renewable source
of "natural" flavour compounds making use of plant genes.
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Kumar, A., Ellis, B. E., 2003. A family of polyketide synthase genes expressed in ripening Rubus fruits. Phytochemistry 62, 513-526.
Quality
traits of raspberry fruits such as aroma and color derive in part from the
polyketide derivatives, benzalacetone and dihydrochalcone, respectively. The
formation of these metabolites during fruit ripening is the result of the
activity of polyketide synthases (PKS), benzalcetone synthase and chalcone
synthase (CHS), during fruit development. To gain an understanding of the
regulation of these multiple PKSs during fruit ripening, we have
characterized the repertoire of Rubus PKS genes and studied their
expression patterns during fruit ripening. Using a PCR-based homology search,
a family of ten PKS genes (Ripks1-10) sharing 82–98%
nucleotide sequence identity was identified in the Rubus idaeus
genome. Low stringency screening of a ripening fruit-specific cDNA library,
identified three groups of PKS cDNAs. Group 1 and 2 cDNAs were also
represented in the PCR amplified products, while group 3 represented a new
class of Rubus PKS gene. The Rubus PKS gene-family thus
consists of at least eleven members. The three cDNAs exhibit distinct
tissue-specific and developmentally regulated patterns of expression.
RiPKS5 has high constitutive levels of expression in all organs,
including developing flowers and fruits, while RiPKS6 and RiPKS11
expression is consistent with developmental and tissue-specific regulation
in various organs. The recombinant proteins encoded by the three RiPKS
cDNAs showed a typical CHS-type PKS activity. While phylogenetic analysis
placed the three Rubus PKSs in one cluster, suggesting a recent
duplication event, their distinct expression patterns suggest that their
regulation, and thus function(s), has evolved independently of the
structural genes themselves.
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Suh, D.-Y., Fukuma, K., Kagami, J., Yamazaki, Y., Shibuya, M., Ebizuka, Y., Sankawa, U., 2000. Identification of amino acid residues important in the cyclization reactions of chalcone and stilbene synthases.
Biochemical Journal 350, 229-235.
Chalcone synthase (CHS) and stilbene synthase (STS) catalyse condensation
reactions of p-coumaroyl-CoA and three C-2 units from malonyl-CoA up to a
common tetraketide intermediate but then catalyse different cyclization
reactions to produce naringenin chalcone and resveratrol respectively. On
the basis of sequence alignment with other condensing enzymes including
3-ketoacyl(acyl carrier protein) synthases of polyketide and fatty-acid
synthases, site-directed mutagenesis was performed on the activesite
G(372)FGPG loops in CHS and STS, The CHS-P375G mutant showed a 6- fold
decrease in overall condensing activity with selectively increased
production of p-coumaroyltriacetic acid lactone (CTAL, the derailment
product of the tetraketide intermediate). Meanwhile, resveratrol production
by STS-P(375)G strongly decreased to give various products in the order CTAL
> resveratrol approximate to bisnoryangonin > naringenin. As a result,
naringenin production (cross-reaction) by STS-P(375)G was close to 30 % of
resveratrol production. Both G(374)L mutants of CHS and STS showed no
condensing activity with residual malonyl- CoA decarboxylase activity. These
results suggested that the G(372)FGPG loop in CHS and STS contribute to a
determination of the outcome during cyclization reactions by serving as a
part of the active-site scaffold on which the stereochemistry of cyclization
is performed. These observations provide the first biochemical indication
that cyclization reactions are modulated by active-site geometry. The
implications for the evolutionary relationship of these enzymes are also
discussed.
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27.03.2009: Update on Figures
-
11.12.2008: Figures, Abstracts of publications
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