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(Last
modification: 24. March 2009)
DIF-1
Biosynthese in Dictyostelium
discoideum
Schlüsselpublikation:
Austin et al., 2006
Im Lebenszyklus der Amöbe Dictyostelium discoideum triggert Hunger einen
komplizierten Differenzierungsprozess; in ihm aggregieren bis zu 100.000 Zellen
zu einer multizellulären Masse, die in Richtung Licht und Wärme wandert.
Differenzierungs-induzierende Faktoren (DIFs) spielen in diesem Prozess wichtige
Rollen. Die Strukturen vieler Moleküle wurden aufgeklärt (Morris
et al., 1987;
Morris et al., 1988; Kay et al., 1988;
Traynor and Kay, 1991;
Kay et al., 1993;
Takaya
et al., 2000; Maeda et al., 2003;
Arai et al., 2005;
Serafimidis and Kay, 2005;
Saito et al., 2006). Die Strukturen
von DIF-1 und anderer vermutlich über PKS-Reaktionen gebildeter Signalmoleküle
sind in Fig. 1 dargestellt.
Fig. 1.
Morphogenetische Faktoren in
Dictyostelium discoideum, bei deren Biosynthese eine Polyketidsynthase
vermutet wird.
Für DIF-1 wurde bald vorgeschlagen, dass die Schlüsselreaktion der Biosynthese
eine Polyketidsynthase (PKS) sein sollte (Kay, 1998),
ein Enzym, welches funktionell gerade so wie eine Chalconsynthase (CHS)
arbeitete, aber mit Hexanoyl-CoA anstelle von 4-Coumaroyl-CoA als Substrat.
Danach sollten zwei Chlorinierungen und eine O-Methylierung folgen. Die
Dictyopyrone enthalten ein Pyron-Ringsystem, ähnlich denen, die sonst in
Naturstoffen oder in Nebenprodukten von Typ III PKS in vitro gefunden
werden. Deshalb erschien es auch hier möglich, dass eine PKS Reaktion ein
Schlüsselelement in der Biosynthese ist. Bei MPBD
(4-Methyl-5-pentylbenzene-1,3-diol)
liess sich aus dem Hydroxylierungsmuster am aromatischen Ring vermuten, dass
eine Stilbensynthase (STS)-Typ Reaktion beteiligt sein könnte. Dies wird auf
einer anderen Seite diskutiert: Mehr...
Diese Seite
beschäftigt sich mit dem Beitrag einer Typ III PKS, die eine
Chalconsynthase-Typ Reaktion durchführt, aber ein anderes Substrat
verwendet.
Schlüssel-Publikation:
Austin et al., 2006
Die Ergebnisse des Dictyostelium discoideum Genomprojektes
erlaubten einen bioinformatischen Ansatz, um herauszufinden, ob die Amöbe
Gene mit signifikanter Ähnlichkeit zu Typ III PKS enthält. Zwei Kandidaten
wurden identifiziert: Sie waren etwa 30% identisch mit typischen Typ III PKS,
aber untereinander waren sie auch sehr verschieden: So um die 30% Identität.
Beide enthielten die Schlüsselelemente, die aus Typ III PKS bekannt sind.
Die Überraschung war, dass die beiden Gene keine
eigenständige Elemente waren, sondern translational an das C-terminale Ende von riesigen offenen
Leserastern (open reading frames, ORFs) fusioniert waren, wie sie typisch für
eukaryotische Fettsäuresynthasen und andere Polyketidsynthasen sind. Ich
erinnere mich noch daran, dass ich vor vielen Jahren einmal die prominenten
Spezialisten der PKSI/II Gebiete fragte: Was würde passieren, wenn man versuchte,
die Typ III PKS mit den riesigen Typ I oder Typ II PKS zu fusionieren? Ich bin
nicht sicher, ob dies nicht inzwischen schon probiert wurde. Aber die Natur war
definitiv sehr erfolgreich damit: Nach meiner Kenntnis sind die in dieser
Publikation beschriebenen Ergebnisse ein erstes Beispiel für hochinteressante
zukünftige Experimente.
Die beiden ORFs wurden 'steely1' (3147 Aminosäuren) und
'steely2' (2968 Aminosäuren) genannt. Es war nicht einfach, die beiden Typ III
Proteindomänen in E. coli als rekombinante Proteine zu erhalten, aber eine
funktionelle Charakterisierung war möglich. Die Ergebnisse werden hier nur für
Hexanoyl-CoA zusammengefasst. Sie zeigten, dass Steely2 die für DIF-1 erwartete
Biosynthese-Reaktion durchführen konnte, d.h. drei Kondensationen gefolgt von einer
CHS-Typ Ringfaltung (Fig. 2). Steely1 konnte das nicht; es machte
immer nur zwei Kondensationen und setzte Pyrone frei (die Zeichnung zeigt ein
Beispiel). Diese Pyrone haben nun wirklich wenig Ähnlichkeiten mit den für
Dictyopyronen typischen Strukturen, und es erscheint sehr fraglich, ob dies
wirklich Vorstufen sind. Falls doch, muss man wohl andere Starter-CoA Ester und
extensive Umstrukturierungen und zusätzliche Reaktionen postulieren. In diesem
Zusammenhang könnte es interessant sein, dass Steely1 im Gegensatz zu Steely2
eine Methyltransferase Domäne enthält (Fig. 3, weiter unten).
Anmerkung 2008: Eine neuere
Publikation zeigte, dass Steely1 nicht nur Pyrone nach zwei Kondensationen
bildet, sondern auch drei Kondensationen durchführen kann, gefolgt von einer
STS-Typ Ringfaltung:
mehr...
Fig. 2.
Austin et al. (2006):
Biosynthese morphogenetischer Faktoren in Dictyostelium discoideum.
Die Schlüssel Typ III PKS Reaktion in der Biosynthese des
Differenzierungs-induzierenden Faktor DIF-1 durch Steely2 (drei Kondensationen,
CHS-Typ Ringfaltung), und in vitro Aktivität von Steely1 (zwei
Kondensationen, Freisetzung eines Triketidpyrons). Das Fragezeichen (?) weist
darauf hin, dass die Biosynthese von Dictyopyronen nicht so leicht durch die
Aktivitäten von Steely1 erklärt werden kann.
Anmerkung: 'Steely1' wurde
zwei Jahre später als ein Enzym mit einer Stilbensynthase (STS)-Typ Reaktion
identifiziert. Das Enzym ist an der Biosynthese des Differenzierungsfaktors MPBD
(4-Methyl-5-Pentylbenzene-1,3-Diol) beteiligt:
Mehr...
Die Publikation enthält noch eine Menge anderer interessanter Ergebnisse und
Diskussionen. Ich möchte hier einige Punkte erwähnen, die ich ganz
spannend fand.
-
Funktionieren diese Typ III PKS
als Dimere?
Alle anderen Proteine dieser
Familie sind Homodimere (zwei gleiche Untereinheiten), und die Interaktion
der beiden ist ein integraler Bestandteil der Enzymreaktionen. Die
Kristallstruktur der einzeln exprimierten Typ III PKS aus Steely1 bestätigt eine homodimere
Struktur. Dies hat einige interessante Konsequenzen für Modelle des
riesigen Gesamtproteins, und das in der Publikation vorgeschlagene Modell
ist in Fig. 3 zusammengefasst.
-
Der
N-terminale Anteil
der riesigen PKS:
Katalysiert er beide Runden der
Kondensations/Modifikations-Reaktionen, die für die Synthese von
Hexanoyl-CoA aus Acetyl-CoA notwendig sind? Dies ist interessant: Wenn ja,
dann wäre das multifunktionelle Protein das ideale Vehikel für
perfekte Kanalisierung von Intermediaten zum Endprodukt. Wie in der
Publikation diskutiert, wäre dies ein wunderbarer Weg, eine Optimierung der
Biosynthesen von Naturstoffen zu erreichen, bei denen Fettsäure-CoA-Ester
als Starter verwendet werden. Beispiele dafür sind:
Olivetolsäure (Cannabis
sativa), Starter: Hexanoyl-CoA;
Sorgoleone (Sorghum bicolor),
Starter: langkettige Fettsäuren;
Anacardsäure
und Urushiole
(Anarcardiaceae), Starter: langkettige Fettsäuren. Ein anderer interessanter
Fall, der hier erwähnt werden sollte: Die Biosynthese von
Alkylresorcinolen und langkettigen Alkylpyronen in Azotobacter
vinelandii:
Eine
Typ I PKS synthetisiert die langkettigen Fettsäuren, die dann direkt aus
der ACP-gebundenen Form an das aktive Cystein der Typ III PKS übergeben
werden: Mehr...
Fig. 3.
Links: Organisation der
Steely1 und Steely2 Gene, und vorgesagte Funktion der Domänen.
Rechts: Modell für die strukturelle Organisation des riesigen
Polyproteins Steely2. Es nimmt an, dass die Typ III PKS als
Dimere funktionieren, genau wie allen anderen bekannten Typ III PKS.
Abkürzungen: KS, ß-Ketoacylynthase; AT, Acyltransferase; DH, Dehydratase;
MT, Methyltransferase; ER, Enoylreduktase; KR,
Ketoreduktase; ACP, Acylcarrierprotein; Typ III
PKS, CHS-verwandtes Protein.
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CHS-Typ Ring-Faltung, aber andere Substrate
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Zitate
-
Austin, M. B., Saito, T., Bowman, M. E., Haydock,
S., Kato, A., Moore, B. S., Kay, R. R., Noel, J. P., 2006. Biosynthesis of
Dictyostelium discoideum differentiation-inducing factor by a hybrid
type I fatty acid-type III polyketide synthase. Nature Chemical Biology 2,
494-502.
Differentiation-inducing factors (DIFs) are well known to
modulate formation of distinct communal cell types from identical
Dictyostelium discoideum amoebas, but DIF biosynthesis remains obscure.
We report complimentary in vivo and in vitro experiments
identifying one of two approximately 3,000-residue D. discoideum
proteins, termed 'steely', as responsible for biosynthesis of the DIF
acylphloroglucinol scaffold. Steely proteins possess six catalytic domains
homologous to metazoan type I fatty acid synthases (FASs) but feature an
iterative type III polyketide synthase (PKS) in place of the expected FAS
C-terminal thioesterase used to off load fatty acid products. This new
domain arrangement likely facilitates covalent transfer of steely
N-terminal acyl products directly to the C-terminal type III PKS active
sites, which catalyze both iterative polyketide extension and cyclization.
The crystal structure of a steely1 C-terminal domain confirms conservation
of the homodimeric type III PKS fold. These findings suggest new
bioengineering strategies for expanding the scope of fatty acid and
polyketide biosynthesis.
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-
Arai, A., Goto, Y., Hasegawa, A., Hosaka, K.,
Kikuchi, H., Oshima, Y., Tanaka, S., Kubohara, Y., 2005. Dictyopyrones,
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Wardroper, A., Felder, M., Thangavelu, M., Johnson, D., Knights, A.,
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