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Verwandtschaftsbaum: Typ III PKS in Oryza sativa (PDF-Datei)                                              
 

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Last modification: 09. May 2010)

'Orphan PKS' in Reis: 'Curcuminoidsynthase'

Schlüsselpublikationen:

• Katsuyama, Y., Hirose, Y., Funa, N., Ohnishi, Y., Horinouchi, S., 2010. Precursor-directed biosynthesis of curcumin analogs in Escherichia coli. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 74, 641-645.

• Katsuyama, Y., Matsuzawa, M., Funa, N., Horinouchi, S., 2007. In vitro synthesis of curcuminoids by type III polyketide synthase from Oryza sativa. Journal of Biological Chemistry 282, 37702-37709.

• Katsuyama, Y., Matsuzawa, M., Funa, N., Horinouchi, S., 2008. Production of curcuminoids by Escherichia coli carrying an artificial biosynthesis pathway. Microbiology 154, 2620-2628.

Sie sollten sich unbedingt auch die neueren Daten über die Curcumin-Biosynthese in Curcuma longa ansehen!!

Einführung

   Curcuminoide gibt es anscheinend nur in den Rhizomen von Curcuma longa, und die dominante Komponente ist Curcumin (Fig. 1). Die Struktur wird oft in der Keto-Form gezeigt, aber neuere Daten lassen darauf schliessen, das die Enol-Form in Lösungen dominant ist  (Payton et al., 2007). Das Rhizom dieser Pflanze wird häufig als Nahrungsmittelzusatz verwendet (Kurkuma, Gelbwurzel), und auch häufig in der asiatischen Medizin; es soll heilende Wirkung bei allen möglichen Krankheiten haben, siehe z.B. neuere Übersichtsartikel: Corson and Crews, 2007; Aggarwal et al., 2007.

Fig. 1.
Struktur von Curcumin

    Vorstufen-Fütterungsexperimente zeigten schon vor langer Zeit, dass das Rückgrat aus zwei Phenylpropanoiden aufgebaut ist (Ferulat im Fall von Curcumin), die durch ein aus Acetat stammendes C-Atom verbunden sind. Der gleiche grundsätzliche Aufbau findet sich in vielen anderen Substanzen, z.B. den Phenylphenalenonen (wie dem Anigorufon), und in den Gingerolen (ein Phenylpropanoid + eine kurzkettige Fettsäure), und Vorschläge für die biosynthetischen Reaktionen wurden ausführlich diskutiert (siehe z.B. den Review in: Cooke and Edwards, 1980).  Für Curcumin waren diese Studien anscheinend nicht schlüssig; sie konnten nicht klar zwischen zwei Möglichkeiten unterscheiden: a) Ein Starter Phenylpropanoid-CoA, fünf Kondensationsreaktionen mit Malonyl-CoA, danach ein Ringschluss, und weitere Modifikationen, und b) Biosynthese aus zwei Phenylpropanoid-CoA und einem Malonyl-CoA  (Roughly and Whiting, 1971; 1973). Viel später (Schröder, 1997) schlug ich vor, dass die Biosynthese all dieser Naturstoffe mit einer Typ III PKS Reaktion beginnt, die der einzigen Kondensation in der Biosynthese des Benzalacetons entspricht (mehr...); das resultierende Diketid sollte die Basis für die Synthese der endgültigen Strukturen sein. Zu der Zeit waren mir die Unsicherheiten über die Biosynthese der Curcuminoide nicht bekannt.
    Tatsächlich gelang es erst 2006, Curcumin-Biosynthese in vitro in Rohextrakten von Curcuma longa nachzuweisen. Die Aktivität konnte nicht gereinigt werden, und daher blieb offen, ob ein oder mehrere Enzyme daran beteiligt waren (Ramirez-Ahumada et al., 2006). 

Neue Daten

     Es war deshalb ganz wichtig: Eine neuere Publikation beschrieb, dass ein einziges Protein, eine rekombinante Typ III PKS aus Reis (Oryza sativa),  die gesamte Reaktions-Sequenz in vitro durchführen konnte, mit Phenylpropanoid-CoA und Malonyl-CoA in der Inkubationsmischung (Katsuyama et al., 2007). Das Enzym wurde CUS (Curcuminoidsynthase) genannt.

     Eine der Überraschungen in dieser Arbeit war die Pflanze: Wer hätte eine solche Reaktion in Reis vermutet; mit der Implikation, dass Reis Curcumin oder verwandte Naturstoffe enthält? Tatsächlich gibt es dafür anscheinend keinerlei Evidenz  in der verfügbaren Literatur. Die Autoren fanden solche Substanzen auch nicht, und schlossen: 'Speculatively, the rice CUS produces curcuminoids, but in undetectable amounts'. Unter diesen Umständen hätte man wohl gerne diesen Zusatz gesehen: 'under the conditions investigated by us',  denn man könnte auch argumentieren, dass 'undetectable' (unentdeckbar) in der Wissenschaft bedeutet: nicht vorhanden.

    Die Autoren stellten fest, dass das Reis-Genomprojekt mehr als 30 Sequenzen als Typ III PKS bezeichnet, und sie merken an, dass sie sie in E. coli exprimierten. Funktionelle Untersuchungen der rekombinanten Proteine zeigten dann, dass eines davon die CUS Aktivität hatte. Schade, dass jede weitere Information fehlt. Es wäre nett gewesen, wenn sie sich ein wenig zu der Verwandtschaft von CUS mit CHS (war schon früher in Reis identifiziert worden) und den anderen Typ III PKS geäussert hätten, und ein paar Angaben über die Art ihrer Aktivitäten wären auch schön gewesen, nachdem sie sich schon die ganze Arbeit gemacht hatten.  Da ich schrecklich neugierig bei Typ III PKS bin, holte ich mir aus der TIGR Datenbase neun Proteinsequenzen von exprimierten Typ III PKS, und machte eine schnelle Verwandtschaftsanalyse: PDF-Datei des Verwandtschaftsbaums. Er zeigte, dass eines der Proteine ganz eng bei CHS von anderen Monokotylen sass; dieses Gen war bereits früher als CHS identifiziert worden (Scheffler et al., 1995; Reddy et al., 1996). Ein weiteres Gen, als Antheren-spezifisch bezeichnet, wurde auch schon früher analysiert  (Hihara et al., 1996; Qu et al., 1997); es hat eine undefinierte Rolle in der Pollen-Entwicklung (Zheng et al., 2000). In dem Baum ist das Protein auf einem extra Zweig, und weit weg von allen anderen Typ III PKS. Die restlichen sieben Proteine bilden eine eigene Gruppe, und CUS sitzt gerade mitten drin. Die Verwandtschaften innerhalb dieser Gruppe sind ziemlich hoch (53 bis 60 % Identität; 60 bis 75 % Ähnlichkeit). Es wäre sicherlich interessant, ob diese ziemlich eng verwandten Proteine ähnliche Funktionen haben (oder nicht).
      Und nun zu den Eigenschaften der neu entdeckten Enzymaktivität. Curcuminoid-Synthese war am besten mit 4-Coumaroyl-CoA, aber unter den meisten Bedingungen (s. unten) dies war nicht das einzige Produkt; ebenso gebildet wurde ein Triketid-Pyron nach zwei Kondensationen mit Malonyl-CoA (d.h. Bisnoryangonin, ein wohlbekanntes Nebenprodukt in Chalcon- und Stilben-Synthase Reaktionen in vitro: mehr...). Das einzige andere Substrat, welches ebenfalls to nennenswerter Curcuminoid Bildung führte, war Cinnamoyl-CoA. Aliphatische CoA-Ester (z.B. Hexanoyl-CoA, Dodecanoyl-CoA) wurden auch als Substrate akzeptiert, aber die Produkte waren immer nur die Pyrone nach zwei Kondensationsreaktionen. Fig. 2 fasst ein Modell für die Reaktionen mit 4-Coumaroyl-CoA zusammen.

Fig. 2.
Modell für die Reaktionen von CUS mit 4-Coumaroyl-CoA in der Biosynthese von Bisnoryangonin und einem Curcuminoid (Bisdemethoxycurcumin).
Sehen Sie sich zum Vergleich die Curcuminoid-Biosynthese in Curcuma longa an.

• 1: In beiden Fällen beginnt die Reaktion mit einem enzymgebundenen [E] 4-Coumarat und einer Kondensation mit Malonyl-CoA zur Bildung eines Diketid-Intermediats. Danach sind die Reaktionen dramatisch verschieden:

• 2a: Bei der Bisnoryangonin-Synthese wird das Diketid zurück übertragen auf das aktive Cystein des Enzyms [E], danach folgt eine zweite Kondensation mit Malonyl-CoA, und das freigesetzte Triketid macht einen Ringschluss zum Pyron (Bisnoryangonin).

• 2b: Bei der Curcuminoid Synthese dient das Diketid (wahrscheinlich als Diketidsäure) als Kettenverlängerer für ein zweites 4-Coumarat welches vorher an das aktive Cystein des Enzyms gebunden wurde [E].

    Angesichts der Unsicherheit ob Curcumin (oder verwandte Substanzen) in Reis überhaupt vorhanden sind, und damit eine physiologische Rolle für CUS, war es natürlich von besonderem Interesse unter welchen Bedingungen in vitro die Synthese des Curcuminoids oder des Bisnoryangonins dominant war. Die Daten zeigten, dass das Verhältnis der beiden Produkte sehr variabel war, und sehr stark abhängig von den Testbedingungen. Zur Erinnerung/Anmerkung: Die Standard-Substratkonzentrationen waren 5 µM  sowohl für 4-Coumaroyl-CoA als auch für Malonyl-CoA (relativ niedrig im Vergleich zu den meist in vitro angewendeten Konzentrationen, und auch bezogen auf die Kms vieler Typ III PKS).
Eine Zusammenfassung einiger Ergebnisse, mit Fokus auf das Verhältnis der beiden in vitro Produkte:

• 1) Abhängigkeit vom pH:
  Bei pH 6.5 bildete das Enzym etwa 6x mehr Pyron als Curcuminoid. Bei pH 7 nahm das Curcuminoid leicht zu während die Pyronbildung reduziert war, aber es gab immer noch mehr Pyron als Curcuminoid. Ein Verhältnis von etwa 1:1 wurde erreicht, wenn der pH auf 7.5 und 8.0 angehoben wurde, 

• 2) Abhängigkeit von Substratkonzentrationen:
  Bei einem grossen Überschuss von 4-Coumaroyl-CoA (50 µM versus 5 µM Malonyl-CoA) war das Curcuminoid das einzige Produkt. Genau umgekehrt war das Ergebnis, wenn die Inkubationen nur 5 µM 4-Coumaroyl-CoA, aber 50 µM Malonyl-CoA enthielten: Das Pyron war das einzige Produkt,

• 3) Während einer Zeitkinetik:
  Hier gab es eine interessante Verschiebung zwischen den Produkten. Das Pyron akkumulierte während der ersten 20 Minuten, aber danach gab es kaum noch eine Zunahme. Dagegen war die Curcuminoid-Bildung sehr niedrig in den ersten 20 Minuten, aber dann nahm sie stark zu bis zu etwa 40 Minuten (etwa 8x mehr als bei Minute 20, und zu diesem Zeitpunkt etwa 2x mehr als das Pyron). Danach nahm das Curcuminoid wieder stark ab, aus ungeklärten Gründen, und es war auch nicht ersichtlich, was daraus entstanden sein könnte (Abbau?).

    Die Ergebnisse in 2) und 3) lassen vermuten, dass die Verfügbarkeit von Malonyl-CoA ein entscheidender Faktor für das Verhältnis zwischen den Produkten ist: Es sieht so aus, als ob Curcuminoid-Bildung dann stattfindet wenn der Kettenverlängerer Malonyl-CoA limitierend ist oder wird.  Eine solche Limitation wird man sicherlich erwarten, wenn 10x mehr 4-Coumaroyl-CoA  als Malonyl-CoA eingesetzt wird (siehe 2). Eine Limitation wird wahrscheinlich unter Standard-Testbedingungen (beide CoA-Ester 5µM) auch einsetzen, wenn das Enzym in den ersten 20 Minuten der Zeitkinetik meist Bisnoryangonin synthetisiert (siehe 3), d.h. zwei Malonyl-CoA, aber nur ein 4-Coumaroyl-CoA verbraucht. Hier muss man auch berücksichtigen, dass überhaupt im Regelfall ziemlich niedrige Substratkonzentrationen eingesetzt wurden (5 µM), und zwar im Verhältnis 1:1.  Die meisten Typ III PKS Enzymteste verwenden ein höheres Malonyl-CoA zu Starter-CoA Verhältnis, wenn mehr als eine Kondensation zu erwarten sind. Und dann könnte es noch einen weiteren verborgenen Faktor für eine Malonyl-CoA Verarmung geben: Bei einigen anderen Typ III  PKS  wurde gezeigt, dass sie eine beträchtliche Malonyl-Decarboxylase Aktivität besitzen (Eckermann et al., 2003), und es wäre interessant, ob CUS eine Ausnahme ist oder nicht.

    Einige Gedanken über das Diketid als Kettenverlängerer, wie es für die Curcuminoid-Synthese postuliert werden muss. Die Autoren favorisieren eine Interpretation, dass es an ein zweites Protein weitergegeben wird, und nicht von dem Enzym verwendet wird, das es produziert hat. Aber eigentlich gibt es dafür keine Evidenz. Man könnte genauso gut argumentieren, das das Diketid von dem Protein weiterverwendet wird, welches es gebildet hat: Man braucht nur anzunehmen, dass das Enzym ein Problem mit dem Re-Transfer des Diketids zum aktiven Cystein hat (für eine zweite Kondensation mit Malonyl-CoA), dass eine Thioesterase-Aktivität des Enzyms das CoASH freisetzt, und dass das Diketid nicht-kovalent am Enzym gebunden bleibt. Dies könnte den Eingang zur Tasche mit dem aktiven Cystein des Enzyms freigeben zur Bindung der zweiten 4-Coumaroyl-Einheit, als Starter für eine weitere Kondensation. Es ist auch möglich, dass das gebundene Diketid die Anlagerung eines Malonyl-Restes (für eine Standard-Kettenverlängerung) blockiert, und damit wäre das Diketid möglicherweise die einzige Einheit, die für eine Kettenverlängerung verfügbar ist: Ergebnis = Curcuminoid. Dieses Modell würde auch zu dem eigentlich unerwarteten Ergebnis passen, das freigesetzte Diketid-Einheiten (als CoA-Ester, freie Säure, oder als Decarboxylations-Produkt = Benzalaceton) nicht nachgewiesen werden konnten: Vielleicht gab es gar keine Freisetzung?

    Wie anderswo in unserer Website besprochen (mehr...): Rückschlüsse von in vitro Daten mit rekombinanten Proteinen auf eine physiologische Funktion sind sehr problematisch, besonders wenn unsicher ist, ob die vorhergesagten Produkte (oder Derivate davon) in der entsprechenden Pflanze überhaupt vorhanden sind.  Die Neigung aller Typ III PKS zur Substrat-Promiskuität und zur Bildung von Nebenprodukten in vitro kann wirklich sehr irreführend sein. Trotzdem, die Ergebnisse in dieser Arbeit sind extrem interessant: Die Synthese eines Curcuminoids durch ein gereinigtes Enzym demonstrierte, dass eine Typ III PKS in der Lage ist, sequentiell in einer geordneten Reihenfolge zwei verschiedene Kettenverlängerer zu verwenden. Dies ist wirklich neu. Etwas Vergleichbares konnte mit einer Typ III PKS aus Wachendorfia thyrsiflora  (Brand et al., 2006) nicht gezeigt werden; dieses Enzym sollte die Schlüssel-Reaktion in der Biosynthese von Diarylheptanoiden und Phenylphenalenonen durchführen (mehr...), und auch gerade da wäre so etwas eine attraktive Möglichkeit. Die Arbeit an dem Reis-Enzym sollte ganz sicher der Startschuss für neue Untersuchungen mit faszinierenden Ergebnissen sein, und sehr wahrscheinlich werden sie auch dabei helfen, die Biosynthese-Enzyme in den Pflanzen zu finden, die wirklich solche Naturstoffe enthalten. Eine geordnete Reihenfolge von verschiedenen Kettenverlängerern wurde in der Biosynthese von C-methylierten Flavonoiden vermutet (Malonyl-CoA -> Methylmalonyl-CoA, und wieder -> Malonyl-CoA), aber dies blieb bis jetzt eine Hypothese (mehr...).

   In der Zusammenfassung: Ausserordentlich interessante Ergebnisse. Jedoch, angesichts der Tatsache (wenigstens bis jetzt), dass die physiologische Rolle des Proteins unklar ist: Das Enzym sollte zur Zeit noch als 'Orphan' bezeichnet werden, also ein Protein auf der Suche nach seiner physiologischen Funktion.

September 2008: CUS kann tatsächlich dazu verwendet werden, Curcuminoide in E. coli zu produzieren (Katsuyama et al., 2008). Alle solche Ansätze haben in Bakterien das Problem, dass E. coli nicht die Phenylpropanoide enthält, die als Substrate für solche Biosynthesen essentiell sind. Wie in früheren Arbeiten dieser Arbeitsgruppe (s. z.B. Katsuyama et al., 2007b) lösten die Autoren dieses Problem durch die Einführung von Genen für zusätzliche Enzyme, in diesem Fall die Phenylalanin Ammonia-Lyase (PAL) aus der Hefe Rhodotorula rubra und eine CoA-Ligase (4CL) aus einer Pflanze (Lithospermum erythrorhizon). Die Tatsache, dass dieses System tatsächlich Curcuminoide produzierte zeigt etwas Wichtiges: Das Enzym hat solche Aktivitäten nicht nur in vitro, sondern auch in vivo. Das ist signifikant, auch wenn diese Bakterien nicht der natürliche Wirt für das Enzym ist. Deshalb kann dies nicht als eindeutiger Beweis gelten, dass dies die Funktion in der Pflanze ist. Für so etwas gibt es ein Beispiel: Eine CHS, die in vivo als Benzalaceton-Synthase (BAS) in E. coli funktionierte, d.h. nur eine Kondensation statt drei ausführte (Beekwilder et al, 2007).

März 2010: Eine weitere Publikation die zeigt dass CUS Curcuminoide produziert, einschliesslich unsymmetrische Substanzen, wenn in E. coli exprimiert: Katsuyama et al., 2010.

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Links zu anderen Beispielen von 'Orphan PKS'

• CHS-A und CHS-B in Ipomoea purpurea:

• Diese Seite: 'Curcuminoidsynthase' in Reis (Oryza sativa)

• Polyfunktionale PKS aus 'Chinese club moss' Huperzia serrata 

• VPS und STS in Psilotum nudum

• ARS (Alkylresorcinolsynthase) aus Physcomitrella patens: Mehr...

• Pilz Typ III PKS: Neurospora crassa

• Bakterielle Typ III PKS: Mycobacterium tuberculosis und Bacillus subtilis

• Bakterielle Typ III PKS: Sorangium cellulosum (ein Myxobacterium)

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Zitate 

• Katsuyama, Y., Hirose, Y., Funa, N., Ohnishi, Y., Horinouchi, S., 2010. Precursor-directed biosynthesis of curcumin analogs in Escherichia coli. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 74, 641-645.
  Curcuminoids, natural products in the rhizome of turmeric, show various biological activities, including antioxidant and antitumor activities. For this reason, curcuminoids have been focused on as potential pharmaceuticals. Exogenous supplementation with various carboxylate precursors in genetically engineered Escherichia coli cells carrying an artificially assembled pathway for curcuminoid biosynthesis led to the production of 17 unnatural curcuminoids.
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• Katsuyama, Y., Matsuzawa, M., Funa, N., Horinouchi, S., 2008. Production of curcuminoids by Escherichia coli carrying an artificial biosynthesis pathway. Microbiology 154, 2620-2628.
      Curcuminoids, which are produced specifically by plants of the order Zingiberales, have long been used as food additives because of their aromatic, stimulant and colouring properties and as traditional Asian medicines because of their anti-tumour, antioxidant and hepatoprotective activities. Curcuminoids are therefore attractive targets for metabolic engineering. An artificial curcuminoid biosynthetic pathway, including reactions of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) from the yeast Rhodotorula rubra, 4-coumarate : CoA ligase (4CL) from Lithospermum erythrorhizon and curcuminoid synthase (CUS) from rice (Oryza sativa), a type III polyketide synthase, was constructed in Escherichia coli for the production of curcuminoids. Cultivation of the recombinant E. coli cells in the presence of tyrosine or phenylalanine, or both, led to production of bisdemethoxycurcumin, dicinnamoylmethane and cinnamoyl-p-coumaroylmethane. Another E. coli system carrying 4CL and CUS genes was also used for high-yield production of curcuminoids from exogenously supplemented phenylpropanoid acids: p-coumaric acid, cinnamic acid and ferulic acid. The yields of curcuminoids were up to approximately 100 mg l(-1). Furthermore, this system gave approximately 60 mg curcumin l(-1) from 10 g rice bran pitch, an industrial waste discharged during rice edible oil production, as a source of ferulic acid.
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• Katsuyama, Y., Matsuzawa, M., Funa, N., Horinouchi, S., 2007. In vitro synthesis of curcuminoids by type III polyketide synthase from Oryza sativa. Journal of Biological Chemistry 282, 37702-37709
      Curcuminoids, major components of the spice turmeric, are used as a traditional Asian medicine and a food additive. Curcumin, a representative curcuminoid, has received a great deal of attention because of its anti-inflammatory, anticarcinogenic, and antitumor activities. Here we report a novel type III polyketide synthase named curcuminoid synthase from Oryza sativa, which synthesizes bisdemethoxycurcumin via a unique mechanism from two 4-coumaroyl-CoAs and one malonyl-CoA. The reaction begins with the thioesterification of the thiol moiety of Cys-174 by a starter molecule, 4-coumaroyl-CoA. Decarboxylative condensation of the first extender substrate, malonyl-CoA, onto the thioester of 4-coumarate results in the formation of a diketide-CoA intermediate. Subsequent hydrolysis of the intermediate yields a ß-keto acid, which in turn acts as the second extender substrate. The ß-keto acid is then joined to the Cys-174-bound 4-coumarate by decarboxylative condensation to form bisdemethoxycurcumin. This reaction violates the traditional head-to-tail model of polyketide assembly; the growing diketide intermediate is hydrolyzed to a ß-keto acid that subsequently serves as the second extender to form curcuminoids. Curcuminoid synthase appears to be capable of the synthesis of not only diarylheptanoids but also gingerol analogues, because it synthesized cinnamoyl(hexanoyl)methane, a putative intermediate of gingerol, from cinnamoyl-CoA and 3-oxo-octanoic acid.
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• Aggarwal, B. B., Sundaram, C., Malani, N., Ichikawa, H., 2007. Curcumin: the Indian solid gold. Advances in Experimental Medicine and Biology 595, 1-75.
     Turmeric, derived from the plant Curcuma longa, is a gold-colored spice commonly used in the Indian subcontinent, not only for health care but also for the preservation of food and as a yellow dye for textiles. Curcumin, which gives the yellow color to turmeric, was first isolated almost two centuries ago, and its structure as diferuloylmethane was determined in 1910. Since the time of Ayurveda (1900 Bc) numerous therapeutic activities have been assigned to turmeric for a wide variety of diseases and conditions, including those of the skin, pulmonary, and gastrointestinal systems, aches, pains, wounds, sprains, and liver disorders. Extensive research within the last half century has proven that most of these activities, once associated with turmeric, are due to curcumin. Curcumin has been shown to exhibit antioxidant, anti-inflammatory, antiviral, antibacterial, antifungal, and anticancer activities and thus has a potential against various malignant diseases, diabetes, allergies, arthritis, Alzheimer's disease, and other chronic illnesses. These effects are mediated through the regulation of various transcription factors, growth factors, inflammatory cytokines, protein kinases, and other enzymes. Curcumin exhibits activities similar to recently discovered tumor necrosis factor blockers (e.g., HUMIRA, REMICADE, and ENBREL), a vascular endothelial cell growth factor blocker (e.g., AVASTIN), human epidermal growth factor receptor blockers (e.g., ERBITUX, ERLOTINIB, and GEFTINIB), and a HER2 blocker (e.g., HERCEPTIN). Considering the recent scientific bandwagon that multitargeted therapy is better than monotargeted therapy for most diseases, curcumin can be considered an ideal "Spice for Life".
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• Beekwilder, J., Van der Meer, I. M., Sibbesen, O., Broekgaarden, M., Qvist, I., Mikkelsen, J. D., Hall, R. D., 2007. Microbial production of natural raspberry ketone. Biotechnology Journal 2, 1270-1279.
     Raspberry ketone is an important compound for the flavour industry. It is frequently used in products such as soft drinks, sweets, puddings and ice creams. The compound can be produced by organic synthesis. Demand for "natural" raspberry ketone is growing considerably. However, this product is extremely expensive. Consequently, there is a remaining desire to better understand how raspberry ketone is synthesized in vivo, and which genes and enzymes are involved. With this information we will then be in a better position to design alternative production strategies such as microbial fermentation. This article focuses on the identification and application of genes potentially linked to raspberry ketone synthesis. We have isolated candidate genes from both raspberry and other plants, and these have been introduced into bacterial and yeast expression systems. Conditions have been determined that result in significant levels of raspberry ketone, up to 5 mg/L. These results therefore lay a strong foundation for a potentially renewable source of "natural" flavour compounds making use of plant genes.
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  Link to brief discussion: raspberry CHS functioned as BAS in E. coli

• Brand, S., Hölscher, D., Schierhorn, A., Svatos, A., Schröder, J., Schneider, B., 2006. A type III polyketide synthase from Wachendorfia thyrsiflora and its role in diarylheptanoid and phenylphenalenone biosynthesis. Planta 224, 413-428.
       Chalcone synthase (CHS) related type III plant polyketide synthases (PKSs) are likely to be involved in the biosynthesis of diarylheptanoids (e.g. curcumin and polycyclic phenylphenalenones), but no such activity has been reported. Root cultures from Wachendorfia thyrsiflora (Haemodoraceae) are a suitable source to search for such enzymes because they synthesize large amounts of phenylphenalenones, but no other products that are known to require CHSs or related enzymes (e.g. flavonoids or stilbenes). A homology-based RT-PCR strategy led to the identification of cDNAs for a type III PKS sharing only approximately 60% identity with typical CHSs. It was named WtPKS1 (W. thyrsiflora polyketide synthase 1). The purified recombinant protein accepted a large variety of aromatic and aliphatic starter CoA esters, including phenylpropionyl- and side-chain unsaturated phenylpropanoid-CoAs. The simplest model for the initial reaction in diarylheptanoid biosynthesis predicts a phenylpropanoid-CoA as starter and a single condensation reaction to a diketide. Benzalacetones, the expected release products, were observed only with unsaturated phenylpropanoid-CoAs, and the best results were obtained with 4-coumaroyl-CoA (80% of the products). With all other substrates, WtPKS1 performed two condensation reactions and released pyrones. We propose that WtPKS1 catalyses the first step in diarylheptanoid biosynthesis and that the observed pyrones are derailment products in the absence of downstream processing proteins.
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• Cooke, R. G., Edwards, J. M., 1980. Naturally occurring phenalenones and related compounds. Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe 40, 153-190.
  No Abstract available.
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• Corson, T. W., Crews, C. M., 2007. Molecular understanding and modern application of traditional medicines: triumphs and trials. Cell 130, 769-774.
       Traditional medicines provide fertile ground for modern drug development, but first they must pass along a pathway of discovery, isolation, and mechanistic studies before eventual deployment in the clinic. Here, we highlight the challenges along this route, focusing on the compounds artemisinin, triptolide, celastrol, capsaicin, and curcumin.
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• Eckermann, C., Schröder, G., Eckermann, S., Strack, D., Schmidt, J., Schneider, B., Schröder, J., 2003. Stilbenecarboxylate biosynthesis: a new function in the family of chalcone synthase related proteins. Phytochemistry 62, 271-286.
     Chalcone (CHS), stilbene (STS) synthases, and related proteins are key enzymes in the biosynthesis of many secondary plant products. Precursor feeding studies and mechanistic rationalization suggest that stilbenecarboxylates might also be synthesized by plant type III polyketide synthases; however, the enzyme activity leading to retention of the carboxyl moiety in a stilbene backbone has not yet been demonstrated. Hydrangea macrophylla L. (Garden Hortensia) contains stilbenecarboxylates (hydrangeic acid and lunularic acid) that are derived from 4-coumaroyl and dihydro-4-coumaroyl starter residues, respectively. We used homology-based techniques to clone CHS-related sequences, and the enzyme functions were investigated with recombinant proteins. Sequences for two proteins were obtained. One was identified as CHS. The other shared 65-70% identity with CHSs and other family members. The purified recombinant protein had stilbenecarboxylate synthase (STCS) activity with dihydro-4-coumaroyl-CoA, but not with 4-coumaroyl-CoA or other substrates. We propose that the enzyme is involved in the biosynthesis of lunularic acid. It is the first example of a STS-type reaction that does not lose the terminal carboxyl group during the ring folding to the end product. Comparisons with CHS, STS, and a pyrone synthase showed that it is the only enzyme exerting a tight control over decarboxylation reactions. The protein contains unusual residues in positions highly conserved in other CHS-related proteins, and mutagenesis studies suggest that they are important for the structure or/and the catalytic activity. The formation of the natural products in vivo requires a reducing step, and we discuss the possibility that the absence of a reductase in the in vitro reactions may be responsible for the failure to obtain stilbenecarboxylates from substrates like 4-coumaroyl-CoA.
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• Hihara, Y., Hara, C., Uchimiya, H., 1996. Isolation and characterization of two cDNA clones for mRNAs that are abundantly expressed in immature anthers of rice (Oryza sativa L.). Plant Molecular Biology 30, 1181-1193.
     The relationship between the length of anthers and the stage of development of microspores was examined in rice (Oryza sativa L. cv. Hayayuki). Anthers of ? 2 mm and 2.1-2.2 mm in length and those ready to dehiscence were determined to be at the uninucleate, binucleate and trinucleate microspore stage, respectively. Two cDNAs (YY1 and YY2), representing genes that are specifically expressed in anthers at the uninucleate microspore stage, were isolated and characterized. YY1 cDNA encoded an open reading frame of 95 amino acids. Eight cysteine residues with the potential to form disulfide bridges were present in the amino acid sequence. There was a hydrophobic region at the N-terminus of the putative protein, suggesting that the YY1 protein might be secreted. This cysteine motif and the hydrophobic N-terminus are conserved among products of several anther-specific genes or cDNAs isolated from various plant species. These proteins are thought to form a superfamily of proteins that are confined to anthers. The YY1 transcript was localized in the tapetal cells and the peripheral cells of the vascular bundle. YY2 cDNA encoded an open reading frame of 389 amino acids and the deduced amino acid sequence exhibited substantial homology to that of chalcone synthase. Expression of YY2 mRNA was confined to the tapetal cells. The genes correspond to YY1 and YY2 cDNAs were shown to exist as single copies in the rice genome.
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• Katsuyama, Y., Funa, N., Miyahisa, I., Horinouchi, S., 2007b. Synthesis of unnatural flavonoids and stilbenes by exploiting the plant biosynthetic pathway in Escherichia coli. Chemistry & Biology 14, 613-621.
      Flavonoids and stilbenes have attracted much attention as potential targets for nutraceuticals, cosmetics, and pharmaceuticals. We have developed a system for producing "unnatural" flavonoids and stilbenes in Escherichia coli. The artificial biosynthetic pathway included three steps. These included a substrate synthesis step for CoA esters synthesis from carboxylic acids by 4-coumarate:CoA ligase, a polyketide synthesis step for conversion of the CoA esters into flavanones by chalcone synthase and chalcone isomerase, and into stilbenes by stilbene synthase, and a modification step for modification of the flavanones by flavone synthase, flavanone 3beta-hydroxylase and flavonol synthase. Incubation of the recombinant E. coli with exogenously supplied carboxylic acids led to production of 87 polyketides, including 36 unnatural flavonoids and stilbenes. This system is promising for construction of a larger library by employing other polyketide synthases and modification enzymes.
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• Payton, F., Sandusky, P., Alworth, W. L., 2007. NMR study of the solution structure of curcumin. Journal of Natural Products 70, 143-146.
     Curcumin [l,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione] is derived from the rhizomes of Curcuma longa. Although early studies concluded that curcumin exists predominantly as a keto-enol tautomer, 1b, in several recent articles the solution structure of curcumin has been represented as a diketone tautomer, 1a. We have investigated the structure of curcumin in solvents ranging in polarity from CDCl3 to mixtures of DMSO-d 6 in water, and in buffered aqueous DMSO-d6 solutions with pH values varying from 3 to 9. The solution structure of curcumin was determined on the basis of NMR techniques, including DEPT, HMQC, HMBC, and COSY. The results of the NMR studies show definitely that curcumin exists in solution as keto-enol tautomers, 1b.
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• Qu, L. J., Zhang, Y., Xie, M., Gu, H., Chen, Z., 1997. A chalcone synthase-like cDNA from rice anther. Sexual Plant Reproduction 10, 181-183.
     The relationship between the length of anthers and the stage of development of microspores was examined in rice (Oryza sativa L. cv. Hayayuki). Anthers of = 2 mm and 2.1-2.2 mm in length and those ready to dehiscence were determined to be at the uninucleate, binucleate and trinucleate microspore stage, respectively. Two cDNAs (YY1 and YY2), representing genes that are specifically expressed in anthers at the uninucleate microspore stage, were isolated and characterized. YY1 cDNA encoded an open reading frame of 95 amino acids. Eight cysteine residues with the potential to form disulfide bridges were present in the amino acid sequence. There was a hydrophobic region at the N-terminus of the putative protein, suggesting that the YY1 protein might be secreted. This cysteine motif and the hydrophobic N-terminus are conserved among products of several anther-specific genes or cDNAs isolated from various plant species. These proteins are thought to form a superfamily of proteins that are confined to anthers. The YY1 transcript was localized in the tapetal cells and the peripheral cells of the vascular bundle. YY2 cDNA encoded an open reading frame of 389 amino acids and the deduced amino acid sequence exhibited substantial homology to that of chalcone synthase. Expression of YY2 mRNA was confined to the tapetal cells. The genes correspond to YY1 and YY2 cDNAs were shown to exist as single copies in the rice genome.
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• Ramirez-Ahumada, M. C., Timmermann, B. N., Gang, D. R., 2006. Biosynthesis of curcuminoids and gingerols in turmeric (Curcuma longa) and ginger (Zingiber officinale): identification of curcuminoid synthase and hydroxycinnamoyl-CoA thioesterases. Phytochemistry 67, 2017-2029.
     Members of the Zingiberaceae such as turmeric (Curcuma longa L.) and ginger (Zingiber officinale Rosc.) accumulate at high levels in their rhizomes important pharmacologically active metabolites that appear to be derived from the phenylpropanoid pathway. In ginger, these compounds are the gingerols; in turmeric these are the curcuminoids. Despite their importance, little is known about the biosynthesis of these compounds. This investigation describes the identification of enzymes in the biosynthetic pathway leading to the production of these bioactive natural products. Assays for enzymes in the phenylpropanoid pathway identified the corresponding enzyme activities in protein crude extracts from leaf, shoot and rhizome tissues from ginger and turmeric. These enzymes included phenylalanine ammonia lyase, polyketide synthases, p-coumaroyl shikimate transferase, p-coumaroyl quinate transferase, caffeic acid O-methyltransferase, and caffeoyl-CoA O-methyltransferase, which were evaluated because of their potential roles in controlling production of certain classes of gingerols and curcuminoids. All crude extracts possessed activity for all of these enzymes, with the exception of polyketide synthases. The results of polyketide synthase assays showed detectable curcuminoid synthase activity in the extracts from turmeric with the highest activity found in extracts from leaves. However, no gingerol synthase activity could be identified. This result was explained by the identification of thioesterase activities that cleaved phenylpropanoid pathway CoA esters, and which were found to be present at high levels in all tissues, especially in ginger tissues. These activities may shunt phenylpropanoid pathway intermediates away from the production of curcuminoids and gingerols, thereby potentially playing a regulatory role in the biosynthesis of these compounds.
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• Reddy, A. R., Scheffler, B. E., Madhuri, G., Srivastava, M. N., Kumar, A., Sathyanarayanan, P. V., Nair, S., Mohan, M., 1996. Chalcone synthase in rice (Oryza sativa L.). Detection of the CHS protein in seedlings and molecular mapping of the CHS locus. Plant Molecular Biology 32, 735-743.
     The chalcone synthase is a key enzyme that catalyses the first dedicated reaction of the flavonoid pathway in higher plants. The chs gene and its protein product in rice has been investigated. The presence of a chalcone synthase (CHS) protein in rice seedlings and its developmental stage-specific expression has been demonstrated by western analysis. The chalcone synthase of rice was found to be immunologically similar to that of maize. A rice cDNA clone, Os-chs cDNA, encoding chalcone synthase, isolated from a leaf cDNA library of an indica rice variety Purpleputtu has been mapped to the centromeric region of chromosome 11 of rice. It was mapped between RFLP markers RG2 and RG103. RG2 is the nearest RFLP marker located at a genetic distance of 3.3 cM. Some segments of chromosome 11 of rice including chs locus are conserved on chromosome 4 of maize. The markers, including chs locus on chromosome 11 of rice are located, though not in the same order, on chromosome 4 of maize. Genetic analysis of purple pigmentation in two rice lines, Abhaya and Shyamala, used in the present mapping studies, indicated the involvement of three genes, one of which has been identified as a dominant inhibitor of leaf pigmentation. The Os-chs cDNA shows extensive sequence homology, both for DNA and protein (deduced), to that of maize, barley and also to different monocots and dicots.
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• Roughley, P. J., Whiting, D. A., 1973. Experiments in the biosynthesis of curcumin. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1,  2379-2388.
     The biogenesis of natural diarylheptanoids is discussed, with particular reference to curcumin [1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)hepta-1,6-diene-3,5-dione], the pigment of Curcuma Ionga rhizome. Methods for the isolation, characterisation, and degradation of curcumin, suitable for biosynthetic work, are reported. In administration of labelled precursors to C. Ionga, [1- and 3-¹⁴C]phenylalanine were incorporated into curcumin without scrambling of the label. [1- and 2-¹⁴C]-Acetate and -malonate were also incorporated, and the fractional distribution of label along the heptane chain was determined; the results do not provide satisfactory support for the expected biosynthetic scheme, in which two cinnamate units condense with one malonate unit. Other interpretations are discussed. [³H]-4-Hydroxy-3-methoxy-, -4-hydroxy-, and -3,4-dihydroxy-cinnamic acids were prepared, and supplied to C. Ionga with [¹⁴C]phenylalanine. The first two cinnamic acids are incorporated into curcumin significantly better than the last, although none was utilised quite as efficiently as phenylalanine.
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• Roughly, P. J., Whiting, D. A., 1971. Diarylheptanoids; the problems of the biosynthesis. Tetrahedron Letters 40, 3741-3745.
  No Abstract available.
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• Scheffler, B. E., Reddy, A. R., Hoffmann, I., Wienand, U., 1995. Chalcone synthase cDNA from rice (Oryza sativa). Plant Physiology 109, 722
  No Abstract available, short sequence paper. 
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• Schröder, J., 1997. A family of plant-specific polyketide synthases: facts and predictions. Trends in Plant Science 2, 373-378.
     The enzymes synthesizing chalcones, stilbenes, and acridones are closely related plant-specific polyketide synthases. Recent results suggest that they belong to a family of condensing enzymes that catalyze the initial key reactions in the biosynthesis of several biologically and pharmaceutically interesting substances. The product range is even more extended by modification of reaction intermediates. Recent analysis has revealed that related sequences occur in bacteria, suggesting that the protein family is much older than previously assumed.
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• Zheng, H. H., Qu, L. J., Liu, M. H., Zhang, Y., Shen, Y. P., Wei, J. M., Pan, N. S., Gu, H. Y., Chen, Z., 2000. An anther-specific chalcone synthase-like gene D5 related to rice pollen development. Chinese Science Bulletin 45, 1921-1926.
      It was shown in a previous analysis that D5 gene from rice (Oryza saliva L.) was an anther-specific gene encoding a chalcone synthase-related protein. In this study, D5 gene was found specifically expressed in tapetum cells as well as in the peripheral cells of the vascular bundle of rice anthers by RNA in situ hybridization. In order to study its function, D5 was transformed into rice in both sense and antisense directions driven by a rice Actin I promoter. It has been observed that the pollen grains from the antisense D5 transgenic rice plants are abnormal, indicating that D5 plays a critical role in rice pollen development.
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File History:

• 09.05.2010: Update on literature: Katsuyama et al. (2010)

• 24.03.2009: Link to curcumin biosynthesis in Curcuma longa

• 04.03.2009: Figures modified

• 25.02.2009: Figure 2, Addition of Abstracts

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