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(Last modification:
03. June 2009)
Polyketid-Reduktasen (PKR) in der Biosynthese von Stilbencarboxylaten
Sehen Sie sich auch diese Seiten an; sie sind wichtig in diesem Zusammenhang:
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Reduktase in der Biosynthese von 6'-Deoxychalconen: Das ist der einzige
gut-dokumentierte Fall für die Interaktion einer Typ III PKS mit einer
Reduktase. Sie sollten sich die Seite ansehen, da sie wichtig für das
Verständnis der Vorschläge für diese Seite hier ist.
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Hydrangea macrophylla
und
Marchantia polymorpha
Stilbencarboxylat-Synthasen (STCS): Die Ergebnisse, mit Hinweis auf die
Wichtigkeit der Reduktion in ihrer Biosynthese.
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Reduktionen müssen auch in
der Biosynthese anderer pflanzlicher Naturstoffe postuliert werden, die über Typ
III PKS gebildet werden, z.B. über
Hexaketid-Synthase und
Oktaketid-Synthase,
und schliesslich auch in der Biosynthese von
Psilotonin.
-
Die für die Biosynthese
von Anacardsäure und Urushiolen
postulierten Reaktionen zeigen auch eine Korrelation zwischen Retention der
terminalen Carboxylgruppe und einem Reduktionsschritt.
Stilbencarboxylat-Biosynthese: Postulierte Polyketid-Synthase (PKR)
Fig. 1 fasst zusammen: Die
gegenwärtigen Vorstellungen über die Interaktion der PKR mit der
Chalcon-Synthase in der Bildung von 6'-Deoxychalconen
(links), und einen ähnlichen Mechanismus für die Synthese der reduzierten
Stilbencarboxylate (rechts).
Fig. 1.
Polyketid-Reduktase (PKR) in der
Biosynthese von 6'-Deoxychalcon (CHS) und Hydrangeinsäure (STCS).
Vorschlag 1:
In beiden Fällen findet die Reduktion statt nachdem die Enzyme bereits den neuen
Ringschluss durchgeführt haben, aber nicht die Aromatisierung zu den
Endprodukten:
Ein 'Trion' (CHS, Claisen-Kondensation, drei
Carbonylgruppen am neuen Ringsystem) oder zu einem 'Dion'
(STCS, Aldol-Kondensation, zwei Carbonylgruppen am neuen Ringsystem). Die
roten Punkte markieren die beiden
Kohlenstoff-Atome, welche in der ersten Kondensations-Reaktion eingeführt
werden.
Bei der CHS wird heute angenommen, dass das PKR-Substrat ein
freigesetztes 'Trion'
ist, d.h. mit fertiger CHS-Ringstruktur (Claisen-Kondensation), aber ohne die
Aromatisierung zum Endprodukt, dem Chalcon
(Bomati et al., 2005). Es ist ziemlich plausibel zu
spekulieren, dass ein ähnlicher Mechanismus bei der Bildung der reduzierten
Stilbencarboxylate aktiv ist: Auch hier muss eine Reduktion stattfinden, und zwar
an der gleichen Position wie bei der CHS-Reaktion, d.h. an der Carbonyl-Gruppe,
welche durch die erste Kondensation eingeführt wurde (s. Abbildung oben).
Der Vorschlag 1 (Fig. 1) nimmt an, dass STCS-Typ Ringfaltung
durch das Enzym durchgeführt wird, ebenso wie die Chalcon-Typ Ringfaltung durch die
CHS. Dies ist jedoch weder bewiesen noch zwingend, und eine Alternative wurde in
der Arbeit vorgeschlagen, in der die 3D-Struktur einer Stilbensynthase
beschrieben wurde (Austin
et al., 2004). Dieser Vorschlag beruft sich auf das Verhalten von
Modell-Substanzen in wässriger Lösung: es liess vermuten, dass ein lineares
Tetraketid in Lösung eine Tendenz dazu hat, sich nicht-enzymatisch in die
Ring-Struktur mit der Carboxylat-Konfiguration umzulagern. Wenn das hier für unsere Reaktionen
zutrifft, wäre es ausreichend, wenn die STCS die drei Kondensationen durchführt
und dann das lineare Tetraketid freisetzt: Dies würde in ein pH-abhängiges
Gleichgewicht mit dem labilen Tetraketid-Pyron (CTAL) eingehen, und
schliesslich würde die Endstation des stabilen Stilbencarboxylats erreicht, wie
in Vorschlag 2 (Fig. 2) gezeigt. Der kritische Unterschied zum Vorschlag 1 ist, dass der
Ringschluss zum Stilbencarboxylat nicht-enzymatisch ist. Damit kommt als Substrat für
die PKR nicht nur das 'Dion' in Frage, sondern auch das freigesetzte lineare
Tetraketid.
Fig. 2.
Mögliche Substrate für eine Polyketid-Reduktase (PKR) in der Biosynthese von
Hydrangeinsäure.
Vorschlag 2: Die Reduktion findet entweder an einem
freigesetzten Tetraketid statt oder an einem Dion, welches bereits die STS-Typ
Ringfaltung enthält, aber ohne die Aromatisierung.
Mit 4-Coumaroyl-CoA als Substrat wurden prä-aromatische Intermediate mit
der neu gebildeten Ring-Struktur bisher noch nicht nachgewiesen, weder bei der CHS noch
bei der STCS. Dies kann mit anderen Substraten anders sein, und
Dihydro-4-Coumaroyl-CoA (bei ihm fehlt die
Doppelbindung in der Propenyl-Einheit) ist ein interessantes Beispiel. Es ist
das Substrat für die Biosynthese der Lunularsäure, welche in
Hydrangea macrophylla und
in dem Lebermoos Marchantia
polymorpha vorkommt. Diese fehlende Doppelbindung hat offensichtlich
drastische Konsequenzen für die Stabilität und Ausbildung der Produkte: In M.
polymorpha ist eine prä-aromatische Form,
Prälunularsäure, tatsächlich das erste identifizierbare Produkt in vivo
! In dem Zusammenhang ist es signifikant, dass unsere STCS aus
H. macrophylla und
M. polymorpha mit diesem Substrat sehr wohl ein Stilbencarboxylat
synthetisieren konnten, etwas das mit
4-Coumaroyl-CoA
nicht erreicht wurde. Unsere
Publikation über die
Hydrangea STCS diskutiert dies in mehr Detail. Auf den funktionellen
Unterschied zwischen Dihydro-4-Coumaroyl-CoA und 4-Coumaroyl-CoA wird auf einer
anderen Seite in mehr Detail eingegangen:
Mehr.....
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PKR Kandidaten aus
H. macrophylla
Dies sind interessante Fragen, und deshalb versuchten wir, Kandidaten für solche
Reduktasen aus Hydrangea macrophylla zu klonieren. Wir benutzten eine
RT-PCR Strategie mit degenerierten Primern von den PKRs, die von der
CHS-Interaktion bekannt waren. Wir erhielten cDNAs für zwei Kandidaten, und klonierten und
analysierten auch die Gene: Sie waren als Tandem arrangiert, dicht
nebeneinander. Diese Analyse war in den Jahren 2000 - 2003.
Die beiden
Hydrangea macrophylla
Proteine wurden durch
Trevor Penning (University of Pennsylvania) der Aldo-Keto-Reduktasen (AKR)
Subfamilie 4b zugeordnet. Wir danken ihm für die Zuordnung! Diese Subfamilie
scheint Pflanzen-spezifisch zu sein; sie enthält die Polyketide Reductase (PKR)
in der Biosynthese von 6-'Deoxychalcon in Sesbania rostrata (4B1,
Goormachtig et al., 1999),
zwei Codeinon-Reduktasen (4B2, 4B3,
Unterlinner et al., 1999),
eine D-Galacturonat-Reduktase aus Fragraria ananassa (4B4, GenBank:
AAB97005), und Deoxymuginsäure-Synthasen aus Zea mays, Oryza sativa,
Hordeum vulgare, und Triticum aestivum (4B5, 4B6, 4B7, 4B8,
Bashir et al., 2006).
Die vollständige Liste der
Mitglieder der AKR Superfamilie und noch viel mehr Information ist hier:
http://www.med.upenn.edu/akr/members.shtml.
Wir
exprimierten die cDNAs in rekombinante Proteine mit verschiedenen Strategien in
E. coli, und versuchten herauszufinden, ob sie mit STCS interagierten,
d.h. zur Synthese reduzierter Stilbencarboxylate führten. Unglücklicherweise
gelang es uns mit keinem Trick, die Proteine in löslicher Form zu erhalten. Also
waren die Experimente nicht möglich, und deshalb gaben wir die Sequenzen einfach
so in die Datenbanken (2004), in der Hoffnung, dass
jemand anders etwas damit anfangen kann.
Noch
eine letzte Überlegung möchte ich hier machen. Wie oben erwähnt: Wenn man die
Position im Tetraketid-Intermediat betrachtet, muss die Reduktion bei CHS und
STCS an der gleichen Ketogruppe ansetzen, und darauf beruhte auch der
ursprüngliche Denkansatz, dass die Reduktasen in der Synthese von
6'-Deoxychalcon und Stilbencarboxylaten eigentlich ziemlich ähnlich sein
sollten. Nach den neuen Modell-Überlegungen muss man wohl vermuten, dass
umgedacht werden sollte. Fig. 3 vergleicht die Moleküle, die heute bei CHS und
STCS als Substrate für Reduktasen diskutiert werden. Wenn man sich diese
Moleküle ansieht, kann man von grossen Ähnlichkeiten nicht mehr ausgehen!
Fig. 3.
Unterschiede zwischen CHS und STCS in der Interaktion mit Reduktasen.
Vergleich der Moleküle (rote Boxen), die heute als
Substrate für Reduktasen in der Biosynthese von 6'-Deoxychalconen (CHS) und
Stilbencarboxylaten (STCS) diskutiert werden.
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Zusatz November 2007:
Ein kürzlicher Versuch zur Klonierung von Polyketid-Reduktasen (PKR) aus
Aloe arborescens hatte
ein sehr ähnliches Ergebnis: Ein Kandidat wurde kloniert, aber das rekombinante Protein
hatte keine PKR-Aktivität. Die Teste zeigten, dass es eine Aldo-Keto-Reduktase war, welche die NADPH-abhängige Reduktion von verschiedenen anderen Substanzen
durchführte, z.B. Benzaldehyd und DL-Glycerinaldehyd (Morita
et al., 2007). Das Protein
wurde von
Trevor Penning (University of
Pennsylvania) der AKR Unterfamilie 4C zugeordnet. Diese Unterfamilie scheint
Pflanzen-spezifisch zu sein, und enthält Aldehyd/Aldose-Reduktasen, aber keine
Polyketid-Reduktasen (http://www.med.upenn.edu/akr/members.shtml).
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Zitate
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Austin, M.B.;
Bowman, M.E.; Ferrer, J.-L.; Schröder, J.; Noel ,J.P.:
An aldol switch discovered in stilbene synthases mediates cyclization
specificity of type III polyketide synthases.
Chemistry & Biology 11, 1179-1194 (2004)
Stilbene synthase (STS) and chalcone synthase (CHS) each catalyze the
formation of a tetraketide intermediate from a CoA-tethered phenylpropanoid
starter and three molecules of malonyl-CoA, but use different cyclization
mechanisms to produce distinct chemical scaffolds for a variety of plant
natural products. Here we present the first STS crystal structure, and
identify, by mutagenic conversion of alfalfa CHS into a functional stilbene
synthase, the structural basis for the evolution of STS cyclization
specificity in type III polyketide synthase (PKS) enzymes. Additional
mutagenesis and enzymatic characterization confirms that electronic effects
rather than steric factors balance competing cyclization specificities in CHS
and STS. Finally, we discuss the problematic in vitro reconstitution of
plant stilbenecarboxylate pathways, using insights from existing biomimetic
polyketide cyclization studies to generate a novel mechanistic hypothesis to
explain stilbenecarboxylate biosynthesis.
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Bomati,
E. K., Austin, M. B., Bowman, M. E., Dixon, R. A., Noel, J. P., 2005.
Structural elucidation of chalcone reductase and implications for
deoxychalcone biosynthesis. Journal of Biological Chemistry 280, 30496-30503.
4,2',4',6'-Tetrahydroxychalcone (chalcone) and 4,2',4'-trihydroxychalcone (deoxychalcone)
serve as precursors of ecologically important flavonoids and isoflavonoids.
Deoxychalcone formation depends on chalcone synthase and chalcone reductase;
however, the identity of the chalcone reductase substrate out of the
possible substrates formed during the multistep reaction catalyzed by
chalcone synthase remains experimentally elusive. We report here the
three-dimensional structure of alfalfa chalcone reductase bound to the NADP+
cofactor and propose the identity and binding mode of its substrate, namely
the non-aromatized coumaryl-trione intermediate of the chalcone
synthase-catalyzed cyclization of the fully extended coumaryl-tetraketide
thioester intermediate. In the absence of a ternary complex, the quality
of the refined NADP+-bound chalcone reductase structure serves as a template
for computer-assisted docking to evaluate the likelihood of possible
substrates. Interestingly, chalcone reductase adopts the three-dimensional
structure of the aldo/keto reductase superfamily. The aldo/keto reductase
fold is structurally distinct from all known ketoreductases of fatty acid
biosynthesis, which instead belong to the short-chain dehydrogenase/reductase
superfamily. The results presented here provide structural support for
convergent functional evolution of these two ketoreductases that share
similar roles in the biosynthesis of fatty acids/polyketides. In addition,
the chalcone reductase structure represents the first protein structure of a
member of the aldo/ketoreductase 4 family. Therefore, the chalcone reductase
structure serves as a template for the homology modeling of other aldo/keto-reductase
4 family members, including the reductase involved in morphine biosynthesis,
namely codeinone reductase.
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Eckermann, C., Schröder, G., Eckermann, S., Strack, D., Schmidt, J., Schneider, B., and Schröder, J.: Stilbenecarboxylate biosynthesis: a new function in the family of chalcone synthase-related proteins. Phytochemistry 62, 271-286 (2003b).
Chalcone (CHS), stilbene (STS) synthases, and related proteins are key enzymes in the biosynthesis of many secondary plant products. Precursor feeding studies and mechanistic rationalization suggest that stilbenecarboxylates might also be synthesized by plant type III polyketide synthases; however, the enzyme activity leading to retention of the carboxyl moiety in a stilbene backbone has not yet been demonstrated. Hydrangea macrophylla L. (Garden Hortensia) contains stilbenecarboxylates (hydrangeic acid and lunularic acid) that are derived from 4-coumaroyl and dihydro-4-coumaroyl starter residues, respectively. We used homology-based techniques to clone CHS-related sequences, and the enzyme functions were investigated with recombinant proteins. Sequences for two proteins were obtained. One was identified as CHS. The other shared 65-70% identity with CHSs and other family members. The purified recombinant protein had stilbenecarboxylate synthase (STCS) activity with dihydro-4-coumaroyl-CoA, but not with 4-coumaroyl-CoA or other substrates. We propose that the enzyme is involved in the biosynthesis of lunularic acid. It is the first example of a STS-type reaction that does not lose the terminal carboxyl group during the ring folding to the end product. Comparisons with CHS, STS, and a pyrone synthase showed that it is the only enzyme exerting a tight control over decarboxylation reactions. The protein contains unusual residues in positions highly conserved in other CHS-related proteins, and mutagenesis studies suggest that they are important for the structure or/and the catalytic activity. The formation of the natural products in vivo requires a reducing step, and we discuss the possibility that the absence of a reductase in the in vitro reactions may be responsible for the failure to obtain stilbenecarboxylates from substrates like 4-coumaroyl-CoA.
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Morita, H., Mizuuchi, Y., Abe, T., Kohno, T.,
Noguchi, H., Abe, I., 2007. Cloning and functional analysis of a novel
aldo-keto reductase from Aloe arborescens. Biological and
Pharmaceutical Bulletin 30, 2262-2267.
A novel
aldo-keto reductase (AKR) was cloned and sequenced from roots of Aloe
arborescens by a combination of RT-PCR using degenerate primers based on the
conserved sequences of plant polyketide reductases (PKRs) and cDNA library
screening by oligonucleotide hybridization. A. arborescens AKR share
similarities with known plant AKRs (40-66% amino acid sequence identity),
maintaining most of the active-site residues conserved in the AKR
superfamily enzymes. Interestingly, despite the sequence similarity with
PKRs, recombinant enzyme expressed in Escherichia coli did not
exhibit any detectable PKR activities. Instead, A. arborescens AKR
catalyzed NADPH-dependent reduction of various carbonyl compounds including
benzaldehyde and DL-glyceraldehyde. Finally, a homology model on the basis
of the crystal_structure of Hordeum vulgare AKR predicted active-site
architecture of the enzyme.
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Bashir, K., Inoue, H., Nagasaka, S., Takahashi, M.,
Nakanishi, H., Mori, S., Nishizawa, N. K., 2006. Cloning and characterization
of deoxymugineic acid synthase genes from graminaceous plants.
Journal of Biological Chemistry 281, 32395-32402.
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Goormachtig, S., Lievens, S., Herman, S., Van
Montagu, M., Holsters, M., 1999. Chalcone reductase-homologous transcripts
accumulate during development of stem-borne nodules on the tropical legume
Sesbania rostrata. Planta 209, 45-52.
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-
Unterlinner, B., Lenz, R., Kutchan, T. M., 1999.
Molecular cloning and functional expression of codeinone reductase: the
penultimate enzyme in morphine biosynthesis in the opium poppy Papaver
somniferum. Plant Journal 18, 465-475.
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