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06. March 2010)
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Übersicht über Themen auf dieser Seite -
Warum könnte Resveratrol wichtig für den Menschen sein: Mehr... -
Warum enthalten nicht alle Pflanzen Resveratrol: Mehr... -
Biosynthese von Resveratrol: Mehr... -
Was ist das Geheimnis der Resveratrolsynthase: Mehr... -
Haben Sie sich jemals gefragt, wann Resveratrol entdeckt wurde, und woher der Name kommt?
Ich versuchte, es herauszufinden: Mehr...
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Pinosylvin ist eng verwandt mit
Resveratrol: was ist das und warum ist diese Substanz interessant:
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Publikationen unserer Arbeitsgruppe, die in dieser Seite zitiert wurden: Mehr...
Einige andere Punkte Was meint die Universität Freiburg zu Resveratrol und seinen Möglichkeiten?
-> Freiburger Uni-Magazin Dezember 2004, Seite 30:
PDF-Datei (65 KB, zurück mit Browser-Back-Button) Dieser Artikel in der New York Times von 2003 lohnt sich zu lesen:
Nicholas Wade: Study Spurs Hope of Finding Way to Increase Human Life
(Zurück mit Browser-Back Button) Es gibt schon viele Angebote für Resveratrol im Internet: Der Link führt zu http://www.amazon.com/gp/homepage.html/: Benutzen Sie die Such-Funktion mit dem Suchbegriff "Resveratrol".
Dies sind Beispiele, keine Empfehlungen, und Fragen über die Qualität kann ich nicht beantworten.
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Noch eine Anmerkung:
Wenn Sie darüber nachdenken, Resveratrol
zu nehmen: Werfen Sie einen Blick auf diese Seiten:
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Warum könnte Resveratrol wichtig für den Menschen sein?
Seit langer Zeit ist bekannt, dass eine Niedrig-Kalorien-Diät in vielen Organismen dazu führt, dass Alterungsprozesse verlangsamt werden und dass die Lebensspanne verlängert werden kann. Die molekularen Mechanismen sind in höheren Organismen immer noch nicht ganz klar. Es gibt jedoch gute Gründe für die Annahme, dass die Prinzipien überall sehr ähnlich sind. Und genau das macht einige Ergebnisse mit der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) so interessant, denn diese Hefe wird häufig als Modell-System verwendet, an dem generell Alterungsprozesse untersucht werden (offensichtlich ist das experimentell am Menschen nicht so gut möglich).
Wenn man diesen Zellen wenig Nahrung gibt (ein bisschen "Hungerdiät"), dann werden bestimmte Gene aktiviert, die im Endeffekt zu längerem Leben der Zellen führen. Dazu gehört z.B. dass DNA-Schäden effektiver als in "vollgefressenen" Zellen repariert werden. Der aufregende neue Befund ist, dass die gleichen Effekte wie durch eine Niedrig-Kalorien-Diät durch bestimmte Stoffe in Pflanzen erreicht werden können. Dazu gehören z.B. Quercetin und einige andere Flavonoide, aber am wirkungsvollsten war Resveratrol (Lebensverlängerung bei Hefe: 70% !!). Das Prinzip funktioniert auch in anderen Organismen (z.B. Fruchtfliegen, und Versuche mit Rhesus-Affen laufen schon eine ganze Weile), aber bei Säugetieren sind diese Wirkungen nicht so einfach zu zeigen, und schon gar nicht beim Menschen (wer kann schon warten, ob das Leben auf 120 Jahre verlängert werden kann?). Die Brisanz liegt in Folgendem: Es ist eine häufig zitierte Zahl, dass in Deutschland fast jeder zweite eigentlich übergewichtig ist, und in den U.S.A. sind es noch mehr. Die gesundheitlichen Konsequenzen sind besorgniserregend, und man kann absehen, dass alleine dadurch eine riesige Kostenwelle auf uns zukommt. Wäre es nicht toll, wenn man all unsere schlechten Essgewohnheiten durch Einnahme einer Pille ausgleichen könnte? Ohne dass man seine falschen Ernährungsgewohnheiten ändern muss? Gibt es tatsächlich einen solchen leichten Weg zu einem langen gesunden Leben?
Resveratrol gibt es nur in Pflanzen, und auch hier nicht überall. Die wichtigsten Nutzpflanzen (Reis, Mais, Roggen, Weizen, Kartoffeln, usw.) enthalten es nicht. Bemerkenswerte Ausnahmen sind Erdnüsse (aber auch nur unter bestimmten Bedingungen) und vor allem Weintrauben
(Vitis
vinifera)
und Wein (vor allem Rotwein) (Mehr...). Tatsächlich ist das Vorhandensein in Wein zur Zeit die beste Erklärung für das sogenannte "französische Paradox": Der statistische Befund ist, dass Franzosen signifikant weniger Herzprobleme haben als z.B. Amerikaner, obwohl ihre Durchschnitts-Ernährung auch nicht besser ist in bezug auf Fett und Cholesterin. Dazu kommt, dass es in der medizinischen Literatur eine grosse Zahl von Publikationen gibt, welche Resveratrol geradezu wunderbare Wirkungen zuschreiben: Schutz gegen Herzkrankheiten, Erhöhung des "guten" HDL-Cholesterins, Hemmung von Blutverklumpungen, Hemmung von Viren-Vermehrung, Hemmung und Blockade von Krebs auf jeder Stufe seiner Entwicklung, inklusive Verhinderung von Anfang an, und so weiter (Link zu einigen Publikationen). Man muss natürlich anmerken, daß alle diese Schlussfolgerungen aus Studien an Modell-Systemen stammen, aber anders ist es ja auch kaum möglich, jedenfalls bei der Neuartigkeit dieser Entdeckungen.
Die letzten Jahre brachten neue,
überraschende Ergebnisse über die Aktivitäten von Resveratrol: Die Regulation
von Sirtuin-Aktivitäten. Dies stellte sich als aufregend heraus, weil die
Einnahme von Resveratrol möglicherweise viele der schlechten Konsequenzen von
Falsch-Ernährung kompensieren könnte, also Übergewicht und Fettleibigkeit inkl.
der daraus resultierenden Krankheiten (ein echtes Problem in den westlichen
"zivilisierten" Ländern). Werfen Sie einen Blick auf ein paar Seiten, die ich
vor einiger Zeit zusammenstellte, über die Aktivitäten von Sirtuinen, und die
Wirkungen von Resveratrol auf wichtige Stoffwechselprozesses:
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Warum enthalten nicht alle Pflanzen Resveratrol? Die Antwort ist einfach: Die meisten Pflanzen enthalten nicht das Enzym, welches dafür notwendig ist, nämlich die Resveratrolsynthase. Interessanterweise ist es tatsächlich nur ein einziges Enzym, und die Substrate für die Synthese des Resveratrol gibt es in allen Pflanzen. Die ersten cDNAs und Gene für eine Resveratrolsynthase wurden aus unserer Arbeitsgruppe bereits in 1988 publiziert (für Erdnuss, Arachis hypogaea) (Schröder et al., 1988), und deshalb kennt man die enzymatische Basis für die Biosynthese seit langer Zeit. Diese und weitere Arbeiten zeigten dann:
Resveratrol ist das bekannteste Mitglied einer Gruppe von Naturstoffen, die als Stilbene zusammengefasst werden, und der generelle Name für die Biosynthese-Enzyme ist Stilbensynthase (STS). Wir beschrieben dann auch cDNAs/Gene für solche Enzyme aus Bäumen, in denen Stilbene vorkommen (aber nicht Resveratrol): Aus der Waldkiefer (Scots pine, Pinus sylvestris) (Fliegmann et al., 1992) und aus der Weymouth-Kiefer (Eastern white pine, Pinus strobus) (Raiber et al., 1995).
Die Untersuchungen der Stilbensynthasen zeigten, dass diese Enzyme zu einer grossen Proteinfamilie gehören, und dass diese Proteine ganz unterschiedliche Rollen in der Biosynthese vieler Naturstoffe haben. Das prominenteste Mitglied (ausser der Resveratrolsynthase) ist die Chalconsynthase (CHS), ein Enzym, welches in allen Pflanzen vorkommt. Es ist das Schlüsselenzym für die Biosynthese vieler anderer Naturstoffe, wie z.B. die Flavonoide und Anthocyane. Zu den Flavonoiden gehört auch das Quercetin, das sehr gute gesundheitliche Wirkungen hat. Seine Biosynthese wird ebenfalls weiter unten kurz angesprochen. Stilben- und Chalcon-Synthasen sind nicht nur eng verwandt (ca. 60-70% identisch in der Aminosäure-Sequenz!), sondern sie benutzen auch die gleichen Substrate, und die Reaktionen sind sehr ähnlich (für die Interessierten: Ein Vergleich der Reaktionen ist weiter unten in dieser Seite). Es ist sehr wahrscheinlich, dass sich die Stilbensynthasen in der Evolution mehrfach und unabhängig aus Chalconsynthasen entwickelt haben (Tropf et al., 1994), durch Prozesse, die allgemein bekannt sind: Gen-Duplikation und dann Mutagenese zu einer neuen Protein-Funktion.
Heutzutage ist es natürlich auch ohne grosse Probleme möglich, auch andere Nutzpflanzen dazu zu bringen, dass sie Resveratrol bilden: Durch Einführung des Gens der Resveratrolsynthase:
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Die Enzymreaktionen: Biosynthese
von Resveratrol, Chalcon,
und Quercetin Das Enzym Resveratrolsynthase benötigt 4-Coumaroyl-CoA und drei Malonyl-CoA. Diese sind in allen Pflanzen vorhanden; sie werden auch von der Chalconsynthase (CHS) verwendet: ein essentielles Enzym in der Biosynthese der überall in Pflanzen vorhandenen Flavonoide und Anthocyane (z.B. Blütenfarbstoffe!). Beide Enzyme sind sogenannte "Polyketidsynthasen" (PKS). Die Reaktionen sind identisch bis zu dem Tetraketid-Intermediat nach den drei Kondensations-Reaktionen mit Malonyl-CoA. Erst danach unterscheiden sie sich, und zwar in der Faltung zu einem neuen aromatischen Ringsystem. Ein wichtiger Unterschied zwischen den beiden Enzymen: Bei der Ringbildung zum Resveratrol wird die endständige Carboxyl-Gruppe als Kohlendioxid (CO2) abgespalten; dies findet bei der Chalconsynthase-Reaktion nicht statt.
- Für die Fachleute: Die Farbkodierung zeigt den biosynthetischen Ursprung der C-Atome aus den drei Malonyl-CoA.
-
Quercetin: Dies ist eine weitere Substanz, die wegen seiner gesundheitsfördernden Wirkung interessant ist; für seine Biosynthese werden CHS und noch ein paar mehr Enzyme benötigt.
Synthese von
Resveratrol (ein Stilben) und von Chalcon (Vorstufe von
Quercetin, ein wichtiges Antioxidant).
Die Schlüsselenzyme sind Stilbensynthase
(STS) und Chalconsynthase (CHS). Beide verwenden 4-Coumaroyl-CoA und führen drei Kondensationsreaktionen mit Malonyl-CoA durch. Das resultierende Tetraketid wird in neue aromatische Ringsysteme gefaltet: Hier liegt der entscheidende Unterschied zwischen der Synthese von Resveratrol (ein Stilben) und Chalcon. Eine einzigartige Eigenschaft der Resveratrolsynthase ist, dass bei der Ringfaltung die terminale Carboxylgruppe als
CO2 abgespalten wird. Die Farben markieren die drei Kondensations-Reaktionen.
Sowohl
Resveratrol als auch Quercetin sind interessante Aktivatoren menschlicher
Sirtuine: Mehr...
Nomenklatur und Nummerierung der Atome:
Chalcone,
Quercetin,
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Was ist das Geheimnis der Resveratrol-Synthase? Warum machen Chalconsynthasen Chalcone, aber Resveratrolsynthasen Resveratrol? Dies war lange Zeit ein Rätsel, aber jetzt liefert die Kristall-Struktur einer Stilbensynthase eine Antwort: Es ist ein neuartiger "molekularer
Schalter", der darüber entscheidet, ob ein solches Protein ein Chalcon oder ein Stilben bildet. Mit diesen Erkenntnissen war es jetzt möglich, eine Chalconsynthase in eine Resveratrolsynthase umzuwandeln, und dazu waren nur Austausche einiger weniger Schlüssel-Aminosäuren notwendig. Und es war auch möglich, Enzyme zu erhalten, die sowohl Chalcon als auch Resveratrol bilden! Diese bahnbrechenden Ergebnisse sind in der September-Ausgabe (2004) der Zeitschrift "Chemistry & Biology" veröffentlicht (Austin et al., 2004), und es lohnt sich, sie mal anzusehen.
Wie wäre es damit, solche Gene in andere Nutzpflanzen einzuführen und ihnen damit die Fähigkeit zur Bildung von Resveratrol zu geben? Eigentlich ist dies keine neue Idee; sie wurde bereits früher in anderem Zusammenhang diskutiert: Stilbene können den Pflanzen dabei helfen, mit Infektionen von Bakterien und Pilzen besser fertig zu werden. Die neuen Aspekte klingen sogar besser: Wie wäre es, mit dem Frühstück etwas Lebenverlängerndes zu sich zu nehmen? Es muss ja nicht gerade Rotwein sein; heute ist es kein Problem mehr, Pflanzen per Gentechnologie so zu verändern, dass sie Resveratrol bilden können. Also, Resveratrol mit dem Brot oder den "Frühstücks-Cerealien" (wie es neuhochdeutsch so schön heisst). Zu schön, um wahr zu sein? Auf jeden Fall gibt es im Internet jede Menge Angebote für Resveratrol in den verschiedensten Darreichungsformen: In aller Regel Extrakte, kein reines Resveratrol (wäre zu teuer). Einige Beispiele können Sie hier finden. Und wenn Sie wollen und auch schon weiter oben angemerkt: Transgene Pflanzen, die Resveratrol synthetisieren, gibt es auch schon:
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Möchten Sie mehr über diese interessante Proteinfamilie wissen?
Mehr finden Sie hier:
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Entdeckung / erste Beschreibung von Resveratrol Früher oder später fragt man sich, wann Resveratrol tatsächlich entdeckt und zuerst beschrieben wurde. Viele Webseiten meinen, dass dies 1963 war, aus der Pflanze
Polygonum cuspidatum (= Fallopia japonica = Reynoutria japonica; Japanese knotweed, Japanischer Staudenknöterich). Interessanterweise wird diese Pflanze heute in vielen westlichen Ländern als 'invasiver Neophyt' angesehen, aber es ist auch der hauptsächlichen Quellen für Resveratrol-Präparate (und anscheinend die billigste!). Soweit ich herausfinden konnte, ist wahrscheinlich folgende Publikation gemeint: Nonomura et al. (1963). Die meisten Webseiten geben das Zitat nicht an, und schon gar nicht die Einzelheiten: Das ist nicht sonderlich überraschend, denn die Publikation ist nicht leicht zugänglich und zudem auf Japanisch; man kann wohl bezweifeln, dass sie von vielen in den westlichen Ländern wirklich gelesen wurde.
Schon eine kurze Literatursuche zeigt, dass dies nicht die erste Beschreibung von Resveratrol ist: Es wurde bereits einige Jahre vorher aus Eucalyptus wandoo beschrieben, einem Eucalyptus in Westaustralien (Hathway and Seakins, 1959). Der englische Name ist 'Powder-barked Wandoo', und der lateinische Name scheint jetzt Eucalyptus accedens zu sein. Die Liste der Zitate zeigte, dass es noch frühere Berichte über Resveratrol gibt, aber wieder in japanischen Zeitschriften. An diese alten Ausgaben kommt man nicht ganz so leicht ran, und viele von uns haben so einige Probleme mit Lesen / Verständnis von japanisch. Deswegen bat ich einen netten Kollegen an der Universität von Tokyo um Hilfe, Prof.
Yutaka Ebizuka, und ich bin ihm sehr dankbar. Die früheste von ihm gefundene Publikation ist tatsächlich von 1939 ! Sie beschreibt die
Identifizierung von Resveratrol in Veratrum grandiflorum (Takaoka, 1939). Die Taxonomie scheint mal wieder etwas kompliziert: 'Veratrum grandiflorum (Maxim. ex Baker) Loes.' ist synonym zu 'Veratrum album L. var. grandiflorum Maxim. ex Baker', d.h. es wird als eine Varietät von Veratrum album (White Hellebore = False Helleborine; Weisser Germer = Nieswurz) angesehen.
Er schickte mir auch einen 'Scan'
der Publikation: Sie ist in Japanisch (ich kann den Scan der japanischen Seiten
schicken, wenn gewünscht), und deshalb war er gleich so nett, den Inhalt für
mich auf Englisch zusammenzufassen. Es ist einfach erstaunlich, mit welch einfachen und effektiven Techniken damals die Wissenschaftler zu excellenten Ergebnissen kamen! So, dies scheint wohl die erste Beschreibung von Resveratrol zu sein: Bitte eine Nachricht, falls Sie noch etwas Früheres kennen!
Eine andere Frage, die mir häufig gestellt wird: Woher stammt der Name 'Resveratrol' eigentlich? Die Publikation von 1939 sagt nichts darüber, aber, wie von dem japanischen Kollegen vorgeschlagen, der Typ des Moleküls und der Pflanzenname machen es leicht, an folgendes zu denken:
Res: könnte sehr wohl eine Abkürzung der Molekül-Klasse sein: Resveratrol gehört zu den
Resorcinolen,
veratr: Abkürzung des Pflanzennamens,
Veratrum,
ol: Die Endung wird ganz allgemein für Substanzen verwendet, die Hydroxylgruppen enthalten: Resveratrol hat drei.
Bitte bescheid sagen, wenn Sie bessere Information oder Ideen haben !
Zur Nomenclatur und Nummerierung der Atome:
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Pinosylvin: Ein eng verwandtes Stilben
Pinosylvin ist
ein Stilben, welches Resveratrol sehr ähnlich ist: Einfach in dem
Biosynthese-Schema das 4-Coumaroyl-CoA durch Cinnamoyl-CoA ersetzen, und dann
die Standard-Stilbensynthase Reaktion durchführen. Cinnamoyl-CoA ist einfach
4-Coumaroyl-CoA ohne die Hydroxylgruppe (-OH) an dem aromatischen Ringsystem.
Dieses Stilben hat auch einiges interessantes medizinisches Potential, wurde
aber nicht so intensiv untersucht. Der Name
Pinosylvin
ist von Pinus
sylvestris
(Waldkiefer) abgeleitet, der Pflanze, aus der es zuerst charakterisiert wurde (Erdtman,
1939a, 1939b; es ist bemerkenswert dass dies in dem gleichen Jahr war, in
dem Resveratrol zuerst beschrieben wurde!). Für diese frühe Charakterisierung
gab es auch einem wirtschaftlichen Grund: Man suchte intensiv nach der Substanz,
die im Kernholz der Kiefer
die Standard-Holzzubereitung über das gängige Sulfit-Verfahren störte (Erdtman
1939b). Natürlich hat uns das Biosynthese-Enzym, die Pinosylvinsynthase,
auch interessiert, und wir klonten diese Stilbensynthasen aus zwei Bäumen: Aus
der Waldkiefer (Pinus
sylvestris)
(Fliegmann et al., 1992,
Schanz et al., 1992)
und aus der
Weymouth-Kiefer (Pinus strobus)
(Raiber et al., 1995)
Zitate
-
Erdtman, H., 1939a. Zur Kenntnis der
Extraktivstoffe des Kiefernkernholzes. Naturwissenschaften 27, 130-131.
No Abstract.
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-
Erdtman, H., 1939b. Die
phenolischen Inhaltsstoffe des Kiefernkernholzes, ihre physiologische
Bedeutung und hemmende Einwirkung auf die normale Aufschließbarkeit des
Kiefernkernholzes nach dem Sulfitverfahren. Justus Liebig's Annalen der
Chemie 539, 116-127.
No Abstract.
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Hathway, D. E., Seakins, J. W. T., 1959. Hydroxystilbenes of Eucalyptus wandoo. Biochemical Journal 72, 369-374.
1. Two hydroxystilbenes have been isolated
from the ether-soluble extractives of Eucalyptus wandoo heartwood by
cellulose- and polyamide- column chromatography.
2. One of the hydroxystilbenes has been identified as
3:5:4'-trihydroxystilbene (= Resveratrol) and the other as
3:5:4'-trihydroxystilbene-3-ß-D-glucoside.
3. In E. warndoo heartwood, the 3:5:4'-trihydroxystilbenes are laid
down within ether-insoluble membrane substances.
4. The translocation, function and ontogenesis of the
3:5:4'-trihydroxystilbenes is discussed.
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Nonomura, S., Kanagawa, H., Makimoto, A., 1963. [Chemical constituents of polygonaceous plants. I. Studies on the components of Ko-Jo-Kon. (Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)] (Übersetzung des japanischen Titels). Yakugaku Zasshi (=
Journal of the Pharmaceutical Society of Japan) 83, 988-990.
Zurück -
Takaoka, M., 1939. [Resveratrol, a new phenolic compound, from Veratrum grandiflorum] (Übersetzung des japanischen Titels).
Nippon Kagaku Kaishi (= Journal of the Chemical Society of Japan)
60, 1090-1100.
Die von Prof. Ebizuka erstellte englische
Zusammmenfassung:
He isolated a phenolic compound, by crystallization alone!!, from an
ether soluble and non-basic fraction of EtOH extracts of Veratrum
grandiflorum Loes. fil. collected in Hokkaido Island. Molecular
formula was obtained by elemental analysis of itself, its triacetate and
trimethylether. CrO3 oxidation of trimethylether in AcOH at
room temperature afforded 3,5-dimethoxybenzaldehyde, while in boiling
AcOH produced p-anisic acid. These degradation products were identified
by direct comparison with authentic specimens. Some additional
information including color reactions and comparison of UV spectrum with
some stilbene derivatives led him to conclude its structure.
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Publikationen unserer Arbeitsgruppe, die hier zitiert wurden:
Titelbild
von Chemistry & Biology, 2004 |
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Austin,M.B.; Bowman,M.E.; Ferrer,J.-L.; Schröder,J.; Noel,J.P.: An aldol switch discovered in stilbene synthases mediates cyclization specificity of type III polyketide synthases. Chemistry & Biology 11, 1179-1194 (2004)
Stilbene synthase (STS) and chalcone synthase (CHS) each catalyze the formation of a tetraketide intermediate from a CoA-tethered phenylpropanoid starter and three molecules of malonyl-CoA, but use different cyclization mechanisms to produce distinct chemical scaffolds for a variety of plant natural products. Here we present the first STS crystal structure, and identify, by mutagenic conversion of alfalfa CHS into a functional stilbene synthase, the structural basis for the evolution of STS cyclization specificity in type III polyketide synthase (PKS) enzymes. Additional mutagenesis and enzymatic characterization confirms that electronic effects rather than steric factors balance competing cyclization specificities in CHS and STS. Finally, we discuss the problematic
in vitro reconstitution of plant stilbenecarboxylate pathways, using insights from existing biomimetic polyketide cyclization studies to generate a novel mechanistic hypothesis to explain stilbenecarboxylate biosynthesis.
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Schröder, G., Brown, J.W.S. and Schröder, J.: Molecular analysis of resveratrol synthase: cDNA, genomic clones and relationship with chalcone synthase. European Journal of Biochemistry 172, 161-169 (1988).
Resveratrol synthase (RS), a key enzyme in biosynthesis of stilbene-type phytoalexins, catalyzes the formation of resveratrol from coumaroyl-CoA and malonyl-CoA. Two cDNA clones, pGSC1 and pGSC2, have been isolated from cDNA libraries established with poly(A)-rich RNA from peanut (Arachis
hypogaea) cell cultures specifically induced for RS. These cDNAs were used to identify two genomic clones (pGSG10 and pGSG11). Sequence analysis shows that the two clones overlap in a large stretch of nearly identical sequences, and that pGSG10 contains the 5' and pGSG11 the 3' end of RS genes. The sequences reveal a single intron, and the size of the predicted protein is 42.7 kDa, in close agreement with that observed in polyacrylamide gels (43 kDa). Chalcone synthase (CHS), a key enzyme of flavonoid biosynthesis, utilizes the same substrates as RS, but the product is different (naringenin chalcone). Comparison of RS with CHS consensus sequences shows that the two genes are related. Homology extends throughout the coding region, and the intron in RS is at the same position as a conserved intron in CHS. However, RS reveals a substantial number of amino acid differences to CHS in positions highly conserved in all CHS enzymes. It is proposed that the two proteins possess a commmon scaffold necessary for binding of the substrates and the type of enzyme reaction, and that the differences are responsible for the formation of different products.
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Fliegmann, J., Schröder, G., Schanz, S., Britsch, L. and Schröder, J.: Molecular analysis of chalcone and dihydropinosylvin synthase from Scots pine (Pinus
sylvestris), and differential regulation of these and related enzyme activities in stressed plants. Plant Molecular Biology 18, 489-503 (1992).
Chalcone synthase (CHS) and stilbene synthase (STS) are closely related polyketide synthases which are key enzymes in the biosynthesis of flavonoids and stilbenes. Scots pine (Pinus
sylvestris) is an interesting plant for a direct comparison of the enzymes. It not only contains the usual flavonoids, but also an unusual chalcone derivative (pinocembrin), and it synthesizes stilbenes of the pinosylvin type. We analysed a CHS and a STS by molecular cloning and functional expression in
Escherichia coli. The CHS was active not only with 4-coumaroyl-CoA (to naringenin chalcone), but also with cinnamoyl-CoA (leading to pinocembrin). The STS was identified as dihydropinosylvin synthase, because it preferred dihydrocinnamoyl-CoA to cinnamoyl-CoA. The protein deviated in 47 positions from the CHS consensus. It had 73.2% identity with the CHS from
P. sylvestris and only 65.3% with a STS from peanut (Arachis
hypogaea). We also investigated the regulation of both enzyme types in
P. sylvestris plantlets exposed to stress. CHS was present in non-stressed plantlets, and induction led to a transient increase with a peak after 16 h. STS1 type activities were regulated differently and were absent in non-stressed plantlets. Increases were observed after a lag period of at least 6 h, and highest activities were obtained after 30 h. The analysis of the reactions in the plant extracts and the substrate specificity of the cloned STS suggest that the plants contain at least two different types of STS: the cloned dihydropinosylvin synthase and a pinosylvin synthase which preferentially utilizes cinnamoyl-CoA as substrate.
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Schanz,
S., Schröder, G. and Schröder, J.: Stilbene synthase from Scots pine (Pinus
sylvestris).
FEBS Letters 313, 71-74
(1992).
Stilbene synthases are named according to their substrate
preferences. By this definition, enzymes preferring cinnamoyl-CoA are
pinosylvin synthases, and proteins with a preference for phenylpropionyl-CoA
are dihydropinosylvin synthases. We investigated the assignment of a
stilbene synthase cloned from Scots pine (Pinus sylvestris) as
dihydropinosylvin synthase and the proposal of an additional pinosylvin
synthase (1992, Plant Mol. Biol. 18, 489-503). The results show that the
previous interpretation was misled by several unexpected factors. Firstly,
we found that the substrate preference and the activity of the
plant-specific protein expressed in Escherichia coli was influenced by
bacterial factors. This was reduced by improvement of the expression system,
and the subsequent kinetic analysis revealed that cinnamoyl-CoA rather than
phenylpropionyl-CoA is the preferred substrate of the cloned stilbene
synthase. Secondly, mixing experiments showed that extracts from P.
sylvestris contain factor(s) which selectively influenced the
substrate preference, i.e. the activity was reduced with phenylpropionyl-
CoA, but not with cinnamoyl-CoA. This explained the apparent differences
between plant extracts and the cloned enzyme expressed in E. coli. Taken
together, the results indicate that the cloned enzyme is a pinosylvin
synthase, and there is no evidence for a second stilbene synthase. This
study cautions that factors in the natural and in new hosts may complicate
the functional identification of cloned sequences.
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Raiber, S., Schröder, G. and Schröder, J.: Molecular and enzymatic characterization of two stilbene synthases from Eastern white pine (Pinus
strobus): a single Arg/His difference determines the activity and the pH dependence of the enzymes. FEBS Letters 361, 299-302 (1995).
Pinus strobus (Eastern white pine) contains stilbenes biosynthetically derived from cinnamoyl-CoA (pinosylvin) or dihydrocinnamoyl-CoA (dihydropinosylvin). We screened a
P. strobus cDNA library with a stilbene synthase (STS) probe from
Pinus sylvestris. The eight isolated cDNAs represented two closely related STS genes with five amino acid differences in the proteins. The enzyme properties were investigated after heterologous expression in
Escherichia coli. Both proteins preferred cinnamoyl-CoA against dihydrocinnamoyl-CoA and thus represented pinosylvin synthases. Otherwise they revealed large differences. STS1 had only 3-5% of the activity of STS2, its pH optimum was shifted to lower values (pH 6), and it synthesized with cinnamoyl-CoA a second unknown product. Site-directed mutagenesis demonstrated that a single Arg-to-His exchange in STS1 was responsible for all of the differences. The proton acceptor properties of His are discussed as the reason for the properties of STS1.
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Tropf, S., Lanz, T., Rensing, S.A., Schröder, J. and Schröder, G.: Evidence that stilbene synthases have developed from chalcone synthases several times in the course of evolution. Journal of Molecular Evolution 38, 610-618 (1994).
Chalcone (CHS) and stilbene (STS) synthases are related plant- specific polyketide synthases that are key enzymes in the biosynthesis of flavonoids and of stilbene phytoalexins, respectively. A phylogenetic tree constructed from 34 CHS and four STS sequences revealed that the STS formed no separate cluster but grouped with CHS from the same or related plants. This suggested that STS evolved from CHS several times independently. We attempted to simulate this by site-directed mutagenesis of an interfamily CHS/STS hybrid, which contained 107 amino acids of a CHS from
Sinapis alba (N-terminal) and 287 amino acids of a STS from
Arachis hypogaea. The hybrid had no enzyme activity. Three amino acid exchanges in the CHS part (Gln-100 to Glu, Val-103 to Met, Val-105 to Arg) were sufficient to obtain low STS activity, and one additional exchange (Gly-23 to Thr) resulted in 20-25% of the parent STS activity. A kinetic analysis indicated (1) that the hybrids had the same Km for the substrate 4-coumaroyl-CoA but a lower Vmax than the parent STS, and (2) that they had a different substrate preference than the parent STS and CHS. Most of the other mutations and their combinations led to enzymatically inactive protein aggregates, suggesting that the subunit folding and/or the dimerization was disturbed. We propose that STS evolved from CHS by a limited number of amino acid exchanges, and that the advantage gained by this enzyme function favored the selection of plants with improved STS activity.
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