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(Last modification: 11.
March 2010)
Stilbencarboxylate in Lebermoosen:
Typ III Polyketidsynthasen aus Marchantia polymorpha
A few pictures, taken from Wikipedia pages on
Marchantiophyta and
the genus Marchantia
Deutsche Seiten:
Lebermoose
The three pictures on the right are from
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Strasburger: Lehrbuch der Botanik für Hochschulen.
G.Fischer, Jena 1900 |
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Marchantia polymorpha, with antheridial and archegonial stalks. |
Marchantia polymorpha |
Life cycle of a typical liverwort |
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Arrangement dieser Seite
Übersicht
Lebermoose enthalten eine grosse Zahl von Naturstoffen, und unter ihnen sind die interessantesten (wenigstens für uns!) diejenigen, welche über eine Polyketidsynthase (PKS) Reaktion gebildet werden, wie bereits vor langer Zeit durch Fütterungs-Studien/Produkt-Analyse gezeigt (Pryce, 1971;
Friederich et al., 1999a). Interessanterweise wurde behauptet, dass Lunularsäure, eine der einfachen Substanzen, auch in Algen und Cyanobakterien vorkommen soll (Pryce, 1972b; Swain, 1975), aber dies wurde später angezweifelt (Gorham, 1977a). Die erste Abbildung fasst die Biosynthese des Grundgerüstes zusammen, und einige der späteren Weiterreaktionen.
Zur Nomenclatur und Nummerierung der Atome:
Mehr...
All diese Naturstoffe stammen ursprünglich aus einer PKS-Reaktion mit Dihydro-4-Coumaroyl-CoA und drei Kondensationen mit Malonyl-CoA, und die Reaktions-Sequenz muss eine Reduktion enthalten. So weit ich weiss, wurde weder die PKS-Reaktion, noch die Reduktase bisher in Pflanzen-Extrakten demonstriert.
Einer der einzigartigen Aspekte in der Biosynthese ist, dass das erste nachweisbare Produkt eine nicht-aromatisierte Verbindung ist,
Prälunularsäure, und
in ihr ist der Reduktionsschritt bereits vollzogen. Unter geeigneten Extraktionsbedingungen ist es viel mehr als das aromatisierte Produkt Lunularsäure (Ohta et al., 1983;
Abe and Ohta, 1984;
Ohta et al., 1984;
Imoto and Ohta, 1985).
Lunularsäure wird dann in Lunularin umgewandelt, durch eine Decarboxylase, die mehrfach in vitro beschrieben wurde (Pryce, 1972a;
Pryce and Linton, 1974;
Gorham, 1977b).
Lunularin ist die Ausgangs-Substanz für die Synthese von Hunderten komplizierterer Substanzen; diese sind in mehreren schönen Übersichtsartikeln zusammengefasst (Gorham, 1995;
Asakawa, 1995; 2001; 2004). Der erste Schritt, eine Kopplung zweier Lunularin-Moleküle zu Marchantin C, und die weitere Hydroxylierung zu Marchantin A werden höchstwahrscheinlich durch P450 Enzyme katalysiert (Friederich et al., 1999b).
Wir interessierten uns für Marchantia aus mehreren Gründen -
Falls die Biosynthese tatsächlich über Typ III PKS verläuft: Dies bereits sollte interessant sein, da sie aus den einfachsten bisher analysierten Pflanzen stammen -
Die Enzyme sollten Stilbencarboxylat-Synthasen (STCS) sein, und der Vergleich mit den STCS aus Hydrangea macrophylla sollte sehr interessant sein -
Ausserdem sollten diese STCS einen weiteren aufschlussreichen Vergleich mit CHS liefern, da Marchantia polymorpha auch Flavone enthält (Apigenin und Luteolin) (Markham, 1988;
Adam and Becker, 1994;
Asakawa, 1995;
Markham et al., 1998), und deshalb auch eine Chalconsynthase (CHS) enthalten muss. CHS-Aktivität wurde auch schon in Rohextrakten aus Marchantia nachgewiesen (Fischer et al., 1995)
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Zusammenfassung unserer Ergebnissse mit
zwei Typ III PKS aus Marchantia polymorpha
Die Biosynthese von
Lunularsäure kann gut über eine Co-Aktion einer Typ III PKS mit einer Reduktase
erklärt werden, genau wie bei praktisch alle anderen Stilbencarboxylate und
deren Derivate (mehr...). Es gelang uns, zwei Gene für Typ III PKS Proteine und ihre cDNAs zu klonieren. Sie wurden als MpSTCS1 und MpSTCS2 bezeichnet (Accession-Nummern und Sequenzen werden weiter unten angegeben). Die wichtigsten Ergebnisse aus der Sequenz-Analyse: -
Die beiden Proteine waren nicht eng verwandt; gerade mal ca. 62% identisch -
Die Verwandtschaft mit typischen CHS war in der selben Grössenordnung, etwa 60-70% Identität. Dies allein war schon ein guter Hinweis, dass es keine CHS waren, denn diese sind meist mehr als 90% identisch, in den unterschiedlichsten Pflanzen -
Wir erhielten keine cDNA für ein Protein, das ganz eng verwandt mit typischen CHS war, obwohl wir ziemlich intensiv suchten -
Die Verwandtschaft zwischen den beiden Marchantia Proteinen und anderen Typ III PKS ist in einem Verwandtschaftsbaum dargestellt. Obwohl die beiden Proteine auf dem selben Zweig sind, so zeigt die Länge der Einzelzweige auch deutlich, dass sie nicht sehr eng verwandt sind. Und wie steht es mit der Ähnlichkeit zu den STCS aus Hydrangea? Noch weniger; offensichtlich kann man so keine Gemeinsamkeiten zwischen STCS aus verschiedenen Pflanzen identifizieren. Das Gleiche gilt für den Vergleich mit den Stilbensynthasen (STS) aus den verschiedensten Pflanzen
Die Proteinsequenzen lieferten also keinen guten Hinweis auf die Funktion der Marchantia Proteine, ausser dass es wahrscheinlich keine Chalconsynthasen (CHS) waren. Also exprimierten wir rekombinante Proteine in E. coli, und untersuchten die Eigenschaften der Enzyme gründlich. Die Ergebnisse waren ganz ähnlich wie bei den STCSs in Hydrangea macrophylla
(mehr...): Beide Proteine synthetisierten mit 4-Coumaroyl-CoA kein Chalcon oder Stilben, sondern nur die Pyrone, die nach zwei und drei Kondensations-Reaktionen möglich sind (d.h. Bisnoryangonin und CTAL,
Hydrangea-Daten:
mehr...). Mit Dihydro-4-Coumaroyl-CoA jedoch fanden wir nicht nur Pyrone, sondern das erwartete Stilbencarboxylat, und zwar mit beiden Marchantia Enzymen
(Hydrangea-Daten:
mehr...). Dieses Substrat ist das, welches für die Lunularinsäure-Synthese postuliert wird (s. oben), und das Ergebnis zeigt damit, dass beide Proteine Stilbencarboxylat-Synthasen (STCS) sind. Die Verteilung der Produkte (Stilbencarboxylat versus Pyrone) war leicht unterschiedlich bei den beiden Enzymen, aber den Grund und eine mögliche funktionelle Bedeutung in vivo kennen wir nicht. Wir wissen auch nicht, warum Marchantia zwei STCS enthält (vielleicht sogar mehr, wenn wir nicht alle erreicht haben!).
Eines der beiden Marchantia STCS wurde kristallisiert (Kooperation mit Jean-Luc Ferrer (Institut de Biologie Structurale J.-P. Ebel, Grenoble, France). Leider war es nicht möglich, den funktionellen Unterschied zu CHS in der
3D-Struktur 'festzunageln', und so blieb offen, was eine CHS von einer STCS strukturell unterscheidet. Vielleicht weniger als ursprünglich angenommen? Mehr dazu finden Sie hier. Die Strukturdaten sind in den Databasen verfügbar (PDB: 2p0u, MMDB: 45327), und die Datei ist hier.
Zusammengefasst: Wie mit Hydrangea macrophylla waren die Experimente mit den Marchantia Proteinen im Prinzip erfolgreich. Aber das Fehlen der postulierten Reduktase bleibt frustrierend, denn wir denken, dass sie ein integraler und essentieller Bestandteil der Stilbencarboxylat-Synthese ist. Die Abbildung unten zeigt ein Modell für die Lunularsäure-Synthese; es
entspricht dem Vorschlag für die Biosynthese der Hydrangeinsäure (mehr...). Zur Beachtung: das postulierte nicht-aromatische Produkt (Prälunularsäure) ist tatsächlich auch in vivo das erste fassbare Produkt der Lunularsäure-Biosynthese, s. oben!
Wir sind nie so weit gekommen, diese Ergebnisse zu publizieren; ich dachte, dass man dies in einer guten Zeitschrift kaum schaffen würde: Sie sehen aus wie eine Wiederholung der Daten mit Hydrangea macrophylla. Wir gaben jedoch die STCS-Sequenzen zur allgemeinen Verfügbarkeit in die Datenbanken, in der Hoffnung, dass sie jemand anders helfen können: -
AY847705 Marchantia polymorpha Stilbencarboxylat-Synthase 1 (STCS1) Gen, -
AAW30009 Stilbencarboxylat-Synthase 1 Protein [Marchantia polymorpha]. -
AY847706 Marchantia polymorpha Stilbencarboxylat-Synthase 2 (STCS2) Gen, -
AAW30010 Stilbencarboxylat-Synthase 2 Protein [Marchantia polymorpha].
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Zitate -
Abe, S., Ohta, Y., 1984. The concentration of lunularic acid and prelunularic acid in liverworts. Phytochemistry 23, 1379-1381.
The amounts of
lunularic acid in suspension cultured cells of Marchantia polymorpha
and thallus of Conocephalum conicum were carefully re-examined
taking into account the presence of prelunularic acid, a possible labile
precursor of lunularic. The true content of lunularic is 2-4 µg/g dry wt
while much larger amounts of prelunularic are present.
Return to stilbenoids or
Return to
flavonoids -
Adam, K. P., Becker, H., 1994. Phenanthrenes and other phenolics from in vitro cultures of Marchantia polymorpha. Phytochemistry 35, 139-143.
Two new
phenanthrenes, 2,3-dimethoxy-7-hydroxyphenanthrene, 2,7-
dihydroxy-3-methoxyphenanthrene, three new biphenanthrenes, 3,3'-
dimethoxy-2,2',7,7'-tetrahydroxy-1,1-biphenanthrene, 3-methoxy-2,
2',3',7,7'-pentahydroxy-1,1'-biphenanthrene, 2,2',3,3',7,7'-
hexahydroxy-1,1'-biphenanthrene, and a new phenylisocoumarin, 3-
(3,4-dihydroxyphenyl)-8-hydroxyisocoumarin, were isolated from the
methanolic extract of sterile cultures of the liverwort Marchantia
polymorpha. Their structures were elucidated from spectroscopic data.
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Asakawa, Y., 1995. Chemical constituents of the Bryophytes,
in:
Progress
in the Chemistry of Organic Natural Products. Springer Verlag, Wien.
Book chapter
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Asakawa, Y., 2001. Recent advances in phytochemistry of bryophytes - acetogenins, terpenoids and bis(bibenzyl)s from selected Japanese, Taiwanese, New Zealand, Argentinean and European liverworts. Phytochemistry 56, 297-312.
Bryophytes contain a large
number of terpenoids and phenolic compounds. Recent topics relating to
the chemical constituents found in 36 Japanese, 3 New Zealand, 2
European, 1 Argentinean and 1 Taiwanese liverworts and 2 Japanese mosses
and their biological activity are discussed. The chemosystematics of
some liverworts as well as the chemical relationship between liverworts
and mosses, and bryophytes and ferns are also discussed.
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Asakawa, Y., 2004. Chemosystematics of the Hepaticae. Phytochemistry 65, 623-669.
Most liverworts (Hepaticae)
contain oil bodies which are composed of lipophilic terpenoids and
aromatic compounds. The chemosystematics of 36 families of the
Jungermannidae and seven families of the Marchantiidae of the Hepaticae
are discussed using terpenoid and aromatic components.
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Fischer, S., Böttcher, U., Reuber, S., Anhalt, S., Weissenböck, G., 1995. Chalcone synthase in the liverwort Marchantia polymorpha.
Phytochemistry 39, 1007-1012.
Chalcone synthase (CHS) activity was
measured in gametophytic tissue of Marchantia polymorpha. The
main product of the enzyme reaction was identified as naringenin which
results from cyclization of the chalcone. Cross-reactivity under native
and denaturing conditions was obtained using antibodies raised against
CHS from three different higher plants, indicating the presence of CHS
protein in M. polymorpha.
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flavonoids -
Friederich, S., Maier, U. H., Deus-Neumann, B., Asakawa, Y., Zenk, M. H., 1999a.
Biosynthesis of cyclic bis(bibenzyls) in Marchantia polymorpha. Phytochemistry 50, 589-598.
Using sterile thallus
tissue of Marchantia polymorpha, the biosynthesis of the cyclic
bis(bibenzyl) marchantin A was investigated. The synthesis of the
radioactively and C-13- labelled precursors for the application
experiments is described. Feeding experiments showed that rings A and C
of the marchantin molecule are derived from the benzene ring of
L-phenylalanine via trans-cinnamic acid and p-coumaric acid. Further
application of C- 13-labelled precursor with subsequent C-13 NMR
spectroscopy proved that dihydro-p-coumaric acid is an intermediate in
marchantin biosynthesis. A phenylpropane/polymalonate pathway using
dihydro-p-coumaric acid and acetate/malonate is proposed for the
biosynthesis of the bibenzyl monomers which were confirmed to be the
building blocks of the marchantin molecule. The bibenzyls in turn are
coupled in a unique way to form the bis(bibenzyl) structure.
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Friederich, S., Rueffer, M., Asakawa, Y., Zenk, M. H., 1999b. Cytochromes P-450 catalyze the formation of marchantins A and C in Marchantia polymorpha. Phytochemistry 52, 1195-1202.
Two specific cytochrome
P-450 enzymes were detected in cell suspension cultures of Marchantia
polymorpha; the first catalyzes the coupling of two molecules of
lunularic acid to form marchantin C and CO2 and the second hydroxylates
marchantin C to marchantin A. Cell free experiments using H-3/C-14
doubly-labeled substrates demonstrated that lunularic acid, and neither
lunularine nor prelunularic acid, is the sole substrate for the coupling
reaction. Both enzymes are dependent on the presence of oxygen and NADPH.
Both reactions were inhibited in the presence of CO in the dark; this
inhibition was partially reversed by white light. In addition, both
reactions were inhibited by typical inhibitors of cytochrome P-450
enzymes such as cytochrome c and ancymidol.
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Gorham, J., 1977a. Lunularic acid and related compounds in liverworts, algae and Hydrangea. Phytochemistry 16, 249-253.
Lunularic acid and
lunularin were detected in 76 species of hepatics, but not in any of the
Anthrocerotales or Algae examined. Lunularic acid, lunularin,
3,4'-dihydroxystilbene and a glycoside of lunularic acid were also
identified in extracts of Hydrangea macrophylla roots, together
with hydrangenol, hydrangeic acid and their glucosides.
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Gorham, J., 1977b. Metabolism of lunularic acid in liverworts. Phytochemistry 16, 915-918.
Abstract not available.
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Gorham, J., 1995. The Biochemistry of the Stilbenoids. Chapman & Hall, London.
Book.
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Imoto, S. A., Ohta, Y., 1985. Intracellular localization of lunularic acid and prelunularic acid in suspension cultured cells of Marchantia polymorpha. Plant Physiology 79, 751-755.
Intracellular localization
of lunularic acid and prelunularic acid in suspension cultured cells of
Marchantia polymorpha L. was studied. The sum of both compounds
was determined as lunularic acid group (LNAs) because of the instability
of prelunularic acid to convert into lunularic acid. Mechanical
disruption of the cells followed by differential centrifugation showed
that LNAs was associated with the supernatant of 100,000 g
centrifugation. Protoplasts isolated from the cells were osmotically
ruptured and the distribution of LNAs among the organelles was examined
by discontinuous density gradient centrifugation of the protoplast
contents. Successful isolation of intact chloroplasts, mitochondria and
peroxisomes free from cytoplasm indicated that LNAs was not accumulated
in these organelles. Flotation techniques resulted in an efficient
isolation of pure vacuoles and revealed that LNAs was distributed almost
equally in the vacuoles and cytoplasm.
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Markham, K. R., 1988. Distribution of flavonoids in the lower plants and its evolutionary significance. In: Harborne, J. B. (Ed.), The Flavonoids, Chapman and Hall, London, pp. 427-468.
Book chapter
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Markham, K. R., Ryan, K. G., Bloor, S. J., Mitchell, K. A., 1998. An increase in the luteolin:apigenin ratio in Marchantia polymorpha on UV-B enhancement. Phytochemistry 48, 791-794.
The effects of varying the
UV-B component in ambient light pn the liverwort, Marchantia
polymorpha are reported. Plants grown under conditions of ambient
light, ambient light lacking UV-B, and ambient light with a 25%
enhancement of incident UV-B showed, with increasing levels of UV-B, a
decrease in growth rate, a decrease in the production of gemmae cups and
an increase in the proportion of dead thallus. Thallus surviving after
three months of summer growth under these conditions showed no
statistically significant increase in flavonoid levels with increasing
UV-B levels. However, HPLC monitoring of individual flavonoids (all of
which are apigenin and luteolin glucuronides) revealed a strong
correlation between increasing UV-B levels and an increase in the ratio
of luteolin to apigenin glycosides. It is considered unlikely that this
change has significantly altered the UV-B screening effectiveness of the
flavonoids. Rather, an improved level of antioxidant defence, or a more
effective dissipation of absorbed UV energy, are proposed as possible
UV-B protectant benefits to the plant.
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Ohta, Y., Abe, S., Komura, H., Kobayashi, M., 1983. Prelunularic acid, a probable intermediate precursor of lunularic acid. First example of a "prearomatic" intermediate in the phenylpropanoid-polymalonate pathway. Journal of the American Chemical Society 105, 4480-4481.
No Abstract available.
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Ohta, Y., Abe, S., Komura, H., Kobayashi, M., 1984. Prelunularic acid in liverworts. Phytochemistry 23, 1607-1610.
Prelunularic acid, the 1st example of an intermediate with a pre-
aromatic structure in the phenylpropanoid-polymalonate pathway, was
isolated from suspension-cultured cells of Marchantia polymorpha.
Its structure, including its absolute configuration, was assigned on the
basis of spectral properties, direct conversion into lunularic acid and
CD circular dichroism measurements on the bis(p-dimethylaminobenzoate)
of the methyl ester. Prelunularic acid was also detected in several
liverworts of Marchantiales and Jungermanniales Porella densifolia,
P. vernicosa, Plagiochila acanthophylla, Conocephalum conicum,
M. paleacea and appears to be the immediate precursor of lunularic
acid instead of the previously postulated hydrangenol or hydrangeic acid.
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Pryce, R. J., 1971. Biosynthesis of lunularic acid - a dihydrostilbene endogenous growth inhibitor of liverworts. Phytochemistry 10, 2679-2685.
Incorporations of
U-14C--phenylalanine, 1-14C-sodium acetate and 14C-hydrangenol (IV) into
lunularic acid (I) by the liverwort Lunularia cruciata are
reported. The results show, that like other plant stilbene derivatives,
lunularic acid can be biosynthesized by the phenylpropanoid-polymalonate
pathway. The phenyldihydroisocoumarin, hydrangenol (IV), and/or its
isomeric stilbene derivative, hydrangeic acid (VI), are probable
intermediates in the biosynthesis of lunularic acid. Although no free or
bound hydrangenol or hydrangeic acid could be detected in the liverwort
they were found to co-occur with lunularic acid, in an acid labile bound
form, in roots of Hydrangea macrophylla. A hypothesis for the
photoperiodic control of liverwort growth by control of lunularic acid
synthesis is presented.
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Pryce, R. J., 1972a. Metabolism of lunularic acid to a new plant stilbene by Lunularia cruciata. Phytochemistry 11, 1355-1364.
The time course of
metabolism of the C15-dihydrostilbene carboxylic acid derivative,
lunularic acid (V), in the liverwort Lunularia cruciata is
reported. One of the primary metabolites of 14C-lunularic acid has been
identified as a new natural C14-dihydrostilbene derivative named
lunularin (IX). Lunularin is the simple decarboxylation product of
lunularic acid and is a normal constituent of the liverwort.
Incorporations of U-14C-Image -phenylalanine, 1-14C-sodium
acetate and 14C-hydrangenol (III) into lunularin by L. cruciata
are also presented. These results establish the previously proposed
intermediary role of C15-stilbene carboxylic acids in the
phenylpropanoid-polymalonate pathway to the C14-stilbene derivatives of
plants. Evidence in support of a hypothesis for the photoperiodic
control of liverwort growth by control of lunularic acid synthesis is
presented. The antifungal activities of lunularic acid and lunularin are
compared in spore germination bioassays.
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Pryce, R. J., 1972b. The occurrence of lunularic acid and abscisic acids in plants. Phytochemistry 11, 1759-1761.
The natural
dihydrostilbene growth inhibitor of liverworts, lunularic acid, is shown
to be of general occurrence in the algae. It could not be detected in
mosses or pteridophytes and is not generally distributed in higher
plants. The chemotaxonomic and phylogenetic significance of the mutually
exclusive occurrence of lunularic acid and abscisic acid in these groups
of plants is discussed.
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Pryce, R. J., Linton, L., 1974. Lunularic acid decarboxylase from the liverwort Conocephalum conicum. Phytochemistry 13, 2497-2501.
No Abstract.
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Swain, T., 1975. Evolution of flavonoid compounds. In: Harborne, J. B., Mabry, T. J., Mabry, H. (Eds.), The Flavonoids, Chapman and Hall, London, pp. 1096-1128.
Book chapter
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File History:
-
11.03.2010: Addition of plant
figures, and Abstracts to References (if available)
-
05.02.2010: Figures
modified
Besuche seit 10. März 2007:
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