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(Last modification: 10. April 2010)
Stilbensynthase (STS)
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Stilbene und Stilbensynthasen (STS)
Diese kurze Übersicht versucht keine vollständige Beschreibung; sie fasst einige Publikationen zusammen, die nach meiner Meinung (sicherlich nicht ohne Vorurteile!) einigermassen wichtige Rollen in der Stilbensynthase Story spielten. Wenn Sie noch schnell einen Blick auf die generelle Reaktion werfen wollen: Hier klicken (Vergleich der Reaktionen von CHS und STS).
Stilbene waren schon sehr früh von Interesse für Naturstoff-Forscher (Erdtman, 1963; Billek, 1964; Billek and Schimpl, 1966). Ihre Biosynthese über eine Polyketid-Reaktion wurde bereits in der berühmten Arbeit diskutiert, welche vorschlug, dass Chalcone und Stilbene aus Phenylpropanoid-Startereinheiten und drei Kondensationsreaktionen mit Acetyl-Einheiten synthetisiert werden (Birch and Donovan, 1953).
Es gibt eine Reihe von Reviews und Buchkapiteln über das Vorkommen und die Biochemie der Stilbene. Nach meiner Kenntnis ist das Buch von Gorham noch immer eines der besten Zusammenfassungen (Gorham, 1995).
Stilbene wurden auch sehr früh als Phytoalexine identifiziert, also Naturprodukte, die an der Widerstandsfähigkeit gegen Schädlinge beteiligt sind, z.B. in Erdnüssen (Ingham, 1976; Keen and Ingham, 1976) und Wein (Langcake and Pryce, 1977a; 1977b).
Wie oben erwähnt wurde eine Polyketidsynthase-Reaktion (PKS) bereits sehr früh vorgeschlagen. Der erste Nachweis der Enzymaktivität in vitro war jedoch viel später, so um 1980 in der Arbeitsgruppe von H. Kindl (Rupprich and Kindl, 1978; Schoeppner and Kindl, 1979; Fritzemeier and Kindl, 1983), und H. Kindl schrieb auch einen zu der Zeit hochmodernen Review (Kindl, 1985).
Nicht viel später wurden die ersten Sequenzen publiziert, aus der Erdnuss (Schröder et al., 1988; Lanz et al., 1990); und später aus Kiefern (Pinus sylvestris and P. strobus) (Fliegmann et al., 1992; Raiber et al., 1995; Schanz et al., 1992), Wein (Melchior and Kindl, 1990; Sparvoli et al., 1994; Wiese et al., 1994), einer Orchidee (Preisig-Müller et al., 1995), einem Rhabarber (Rheum tartaricum) (Samappito et al., 2003), und aus der Hirse (Sorghum bicolor ), einer wichtigen Nutzpflanze (Yu et al., 2005).
Funktionelle Untersuchungen durch gezielte Mutagenese
Die 1990-iger waren eine faszinierende Zeit um etwas über die Mechanismen von CHS- und STS-Aktivitäten herauszufinden, durch gezielte Mutagenese von Aminosäuren, welche interessant erschienen. Zu der Zeit gab es leider noch keine 3D-Strukturen und Modellierungs-Möglichkeiten: Das wären grosse Hilfen gewesen! So verliessen wir uns auf Ideen, die uns bei Sequenz-Vergleichen kamen. Trotzdem, die Ansätze und Ergebnisse waren und sind ganz interessant, und tatsächlich wurden alle unsere wesentlichen Schlussfolgerungen später durch die 3D-Strukturen bestätigt, z.B. von der CHS aus Medicago sativa (Ferrer et al., 1999). Sie veränderte wirklich alles, war von grossem Nutzen, und wurde dann zur Modellierung vieler anderer Typ III PKS verwendet, z.B. bei der Acridonsynthase (ACS), Benzalacetonsynthase (BAS), Benzophenonsynthase (BPS), und so weiter. Allerdings muss auch vermerkt werden, dass Modellierung kaum etwas zum mechanistischen Verständnis der STS-Reaktion beitragen konnte; das Problem war zu kompliziert: Mehr...
Diese Abschnitte fassen unsere Ergebnisse aus dieser Zeit zusammen: -
Identifizierung des Cysteins im aktiven Zentrum von CHS und STS (Lanz et al., 1991):
Alle Polyketidsynthasen (PKS) und kondensierenden Enzyme enthalten ein Cystein im aktiven Zentrum; es ist absolut essentiell für die Reaktion, da es den Starter für die kondensierende Reaktion kovalent binden muss (z.B. den Coumarsäure-Rest bei der CHS und STS). Wir versuchten, dieses Cystein zu identifizieren: Durch gezielte Mutagenese aller Cysteine, die in CHS und STS konserviert sind. Es waren zum Glück nur sechs Stück! Die Untersuchungen der mutierten Proteine zeigten dann ganz eindeutig, dass nur eines der sechs Cysteine absolut notwendig für Enzymaktivität ist, und es war in CHS und STS an der gleichen Stelle (Position 169 der Proteine). Diese Ergebnisse wurden später voll durch alle 3D-Strukturen bestätigt. -
Rolle von Histidin (His) und Glutamin (Gln) neben dem Cystein des aktiven Zentrums (Schröder and Schröder, 1992):
Die meisten zu der Zeit bekannten CHS und STS enthielten gleich neben dem Cystein des aktiven Zentrum ein Motif aus zwei Aminosäuren: Entweder GlnGln oder HisGln oder GlnHis. Was uns faszinierte: Alle CHS enthielten GlnGln, während alle STS entweder GlnHis oder HisGln hatten. Wir spekulierten, dass das His in STS etwas mit dem Typ der Ringfaltung zu tun haben könnte, und tauschten sie in einer CHS und einer STS in alle möglichen Kombinationen aus. Die Ergebnisse der funktionellen Untersuchungen der Mutanten waren ganz interessant, und wir fanden alle Arten von Effekten. Jedoch: Mit dem Typ der Ringfaltung hatten die beiden Aminosäuren offensichtlich nichts zu tun. Im Nachhinein und mit der Kenntnis all der neuen Typ III PKS Sequenzen in den letzten Jahren: Unsere Idee war ganz gut, beruhte aber auf einer zu limitierten Zahl von Sequenzen. -
Evolution in vitro: Umwandlung einer CHS in eine STS (Tropf et al., 1994):
Ein phylogenetischer Baum aus den damals verfügbaren Sequenzen wies deutlich daraufhin, dass sich STS nicht nur einmal, sondern mehrfach im Verlaufe der Evolution aus CHS entwickelte, und zwar in mehreren Pflanzenfamilien. Wir versuchten, dies zu simulieren: Wir konstruierten ein CHS/STS-Hybridprotein, das total inaktiv war; es enthielt am N-Terminus 109 Aminosäuren der CHS aus dem Senf (Sinapis alba), und am C-Terminus 287 Aminosäuren der STS aus der Erdnuss (Arachis hypogaea). Dann untersuchten wir per gezielter Mutagenese, wieviel und welche Änderungen notwendig waren, um ein Protein mit STS-Aktivität zu erhalten. Wie sich herausstellte, waren nur drei Mutagenesen im CHS-Teil nötig, um eine basale STS-Aktivität zu bekommen, und gerade mal eine weitere Änderung reichte aus für eine STS-Aktivität, welche 20-25% der Aktivität der Ausgangs-STS entsprach. Dies würde sicherlich als Startpunkt ausreichen, um durch positive Selektion der neuen Eigenschaft (Erwerb eines neuen Phytoalexins!) relativ schnell Enzyme mit höherer Aktivität zu erhalten. -
Evidenz dass CHS und STS Homodimere sein müssen (Tropf et al., 1995):
Es gab immer wieder Publikationen, dass CHS und STS monomere Proteine sein sollten. Wir entwickelten eine Strategie, um dies zu testen. Zunächst zeigten wir durch 'Cross-Linking' und Mutagenese der dadurch identifizierten Aminosäuren, dass sich an der Position 158 eine Untereinheiten-Kontaktstelle befinden muss. Dies sprach schon dafür, dass die Proteine wirklich Homodimere waren.
Aus der Position ergab sich noch etwas anderes Interessantes: Sie war dicht am Cystein des aktiven Zentrums (Cys169). Es schien also möglich, dass die aktiven Zentren in dem Homodimer eng benachbart waren. War es möglich, dass die beiden Untereinheiten nicht unabhängig arbeiten, sondern bei der Produktbildung kooperieren? Das untersuchten wir dann so: Wir machten eine gleichzeitige Expression von zwei Proteinen, die beide für sich (auf verschiedener Basis!) völlig inaktiv waren, und fragten, ob wir dann Enzymaktivität erhalten könnten: Falls ja, wäre dies nur dann möglich, wenn sich Heterodimere bilden, in denen sich die einzel inaktiven Untereinheiten gegenseitig zu Aktivität komplementieren. Tatsächlich erhielten wir aktive Proteine, sowohl mit CHS als auch mit STS. Dies bewies, dass die beiden Proteine Dimere sind, und dass dies ein essentieller Bestandteil der Enzymreaktion ist.
Eine weiterer interessanter Aspekt der möglichen Nachbarschaft der aktiven Zentren: War es möglich, dass die drei Kondensations-Reaktionen in einer Art 'Ping-Pong' durchgeführt wurden, d.h. abwechselnd in den beiden Untereinheiten? Dies konnten wir testen, da wir eine der zwei Mutanten-Untereinheiten speziell geplant hatten: In ihr war das Cystein im aktiven Zentrum durch Mutagenese inaktiviert. Nun war die entscheidende Frage: Wieviel Kondensationen konnten die Heterodimere durchführen? Nach der oben gestellten Frage gab es zwei Möglichkeiten: a) Nach dem 'Ping-Pong' Modell sollte nur eine Kondensation möglich sein, da nur eine der beiden Untereinheiten ein aktives Zentrum besass; b) Drei Kondensationen waren nur dann möglich, wenn jede Untereinheit alle drei Kondensationen durchführte. Das Ergebnis war ganz klar: Die CHS machte Chalcone, und die STS synthetisierte Stilbene. Also können die Untereinheiten unabhängig voneinander alle drei Kondensationen durchführen! Dies ist völlig in Übereinstimmung mit den Schlussfolgerungen aus den späteren 3D-Strukturen.
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Orphan STS in
Psilotum nudum
Interessanterweise wurden cDNAs für Proteine mit STS-Aktivität auch aus
Psilotum nudum (Nacktfarn, Whisk Fern, einfachste vaskuläre Pflanze) erhalten (Yamazaki et al., 2001). Die Aussage beruhte auf Testen mit rekombinanten Proteinen nach Expression in E. coli: Identifizierung von Produkten, Substrat-Präferenzen. Die funktionelle Identifizierung war eindeutig. Aber ein störendes Element war, dass Stilbene oder andere Naturstoffe, die über eine solche Reaktion synthetisiert werden, aus dieser Pflanze nicht bekannt sind. Interessante Frage: Reflektiert dies einfach unser Nichtwissen? Es ist immer wieder erstaunlich, wie wenig wir über Inhaltstoffe in den meisten Pflanzen wissen!
Nach dem gegenwärtigen Kenntniss-Stand sollte dies Enzym als 'Orphan'
("Waise") gekennzeichnet werden. Aber das kann sich ja ändern:
Vielleicht gibt es ja hier Resorcinol-Typ Naturprodukte, die sich von ganz anderen Substraten ableiten. Das ist durchaus möglich: Die Substrat-Promiskuität der Typ III Enzyme macht es häufig sehr schwierig, durch in vitro Experimente eine vernünftige Aussage über die Funktion in vivo zu erhalten:
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Interesting question: do these presumed
STS enzymes contain the aldol switch found in the Pinus sylvestris STS?
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Links zu anderen Beispielen von 'Orphan PKS'
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Zitate -
Schröder, G., Brown, J. W. S., Schröder, J., 1988.
Molecular analysis of resveratrol synthase: cDNA, genomic clones and relationship with chalcone synthase. European Journal of Biochemistry 172, 161-169.
Resveratrol synthase (RS), a key enzyme in biosynthesis of stilbene-type phytoalexins, catalyzes the formation of resveratrol from coumaroyl-CoA and malonyl-CoA. Two cDNA clones, pGSC1 and pGSC2, have been isolated from cDNA libraries established with poly(A)-rich RNA from peanut (Arachis hypogaea) cell cultures specifically induced for RS. These cDNAs were used to identify two genomic clones (pGSG10 and pGSG11). Sequence analysis shows that the two clones overlap in a large stretch of nearly identical sequences, and that pGSG10 contains the 5' and pGSG11 the 3' end of RS genes. The sequences reveal a single intron, and the size of the predicted protein is 42.7 kDa, in close agreement with that observed in polyacrylamide gels (43 kDa). Chalcone synthase (CHS), a key enzyme of flavonoid biosynthesis, utilizes the same substrates as RS, but the product is different (naringenin chalcone). Comparison of RS with CHS consensus sequences shows that the two genes are related. Homology extends throughout the coding region, and the intron in RS is at the same position as a conserved intron in CHS. However, RS reveals a substantial number of amino acid differences to CHS in positions highly conserved in all CHS enzymes. It is proposed that the two proteins possess a commmon scaffold necessary for binding of the substrates and the type of enzyme reaction, and that the differences are responsible for the formation of different products.
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Lanz, T., Schröder, G., Schröder, J., 1990. Differential regulation of genes for resveratrol synthase in cell cultures of Arachis hypogaea. Planta 181, 169-175.
Resveratrol synthase (RS; EC 2.1.1.-) catalyzes the formation of the phytoalexin resveratrol from 4-coumaroyl-CoA and malonyl-CoA. We present the characterization of new genomic RS sequences (RS3, RS4), and describe studies with gene-specific oligonucleotides on the expression of four different RS sequences (RScDNA, RS1, RS2, RS3) during growth of a cell culture from Arachis hypogaea L. and after application of various inducers (elicitor from Phytophthora megasperma, yeast extract, and dilution of the cultures). Transcripts from RScDNA were induced by all of the factors tested, and they represented the majority of all identified RS RNAs. Expression from RS1 and RS3 was much lower than from RScDNA, and transcripts from RS2 were never detected. Both RS1 and RS3 were induced by elicitor, but they reacted differently from the other inducers: RS1 was induced by yeast extract, but RS3 was not, and RS3 was induced by dilution of the cultures, but RS1 was not. The results indicate that the RS genes in A. hypogaea represent a gene family, and that some of the members are regulated by different signals. The quantitative data also show that the sum of the transcripts identified with gene-specific oligonucleotides was lower than the total amount of RS-specific transcripts, indicating that the cells contain active genes which have not yet been identified.
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Fliegmann, J., Schröder, G., Schanz, S., Britsch, L., Schröder, J., 1992.
Molecular analysis of chalcone and dihydropinosylvin synthase from Scots pine (Pinus sylvestris), and differential regulation of these and related enzyme activities in stressed plants. Plant Molecular Biology 18, 489-503.
Chalcone synthase (CHS) and stilbene synthase (STS) are closely related polyketide synthases which are key enzymes in the biosynthesis of flavonoids and stilbenes. Scots pine (Pinus sylvestris) is an interesting plant for a direct comparison of the enzymes. It not only contains the usual flavonoids, but also an unusual chalcone derivative (pinocembrin), and it synthesizes stilbenes of the pinosylvin type. We analysed a CHS and a STS by molecular cloning and functional expression in Escherichia coli. The CHS was active not only with 4-coumaroyl-CoA (to naringenin chalcone), but also with cinnamoyl-CoA (leading to pinocembrin). The STS was identified as dihydropinosylvin synthase, because it preferred dihydrocinnamoyl-CoA to cinnamoyl-CoA. The protein deviated in 47 positions from the CHS consensus. It had 73.2% identity with the CHS from P. sylvestris and only 65.3% with a STS from peanut (Arachis hypogaea). We also investigated the regulation of both enzyme types in P. sylvestris plantlets exposed to stress. CHS was present in non-stressed plantlets, and induction led to a transient increase with a peak after 16 h. STS1 type activities were regulated differently and were absent in non-stressed plantlets. Increases were observed after a lag period of at least 6 h, and highest activities were obtained after 30 h. The analysis of the reactions in the plant extracts and the substrate specificity of the cloned STS suggest that the plants contain at least two different types of STS: the cloned dihydropinosylvin synthase and a pinosylvin synthase which preferentially utilizes cinnamoyl-CoA as substrate.
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Schanz, S., Schröder, G. and Schröder, J., 1992. Stilbene synthase from Scots pine (Pinus sylvestris).
FEBS Letters 313, 71-74.
Stilbene synthases are named according to their substrate preferences. By this definition, enzymes preferring cinnamoyl-CoA are pinosylvin synthases, and proteins with a preference for phenylpropionyl-CoA are dihydropinosylvin synthases. We investigated the assignment of a stilbene synthase cloned from Scots pine (Pinus sylvestris) as dihydropinosylvin synthase and the proposal of an additional pinosylvin synthase (1992, Plant Mol. Biol. 18, 489-503). The results show that the previous interpretation was misled by several unexpected factors. Firstly, we found that the substrate preference and the activity of the plant-specific protein expressed in Escherichia coli was influenced by bacterial factors. This was reduced by improvement of the expression system, and the subsequent kinetic analysis revealed that cinnamoyl-CoA rather than phenylpropionyl-CoA is the preferred substrate of the cloned stilbene synthase. Secondly, mixing experiments showed that extracts from P. sylvestris contain factor(s) which selectively influenced the substrate preference, i.e. the activity was reduced with phenylpropionyl- CoA, but not with cinnamoyl-CoA. This explained the apparent differences between plant extracts and the cloned enzyme expressed in E. coli. Taken together, the results indicate that the cloned enzyme is a pinosylvin synthase, and there is no evidence for a second stilbene synthase. This study cautions that factors in the natural and in new hosts may complicate the functional identification of cloned sequences.
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Raiber, S., Schröder, G., Schröder, J., 1995. Molecular and enzymatic characterization of two stilbene synthases from Eastern white pine (Pinus strobus): a single Arg/His difference determines the activity and the pH dependence of the enzymes. FEBS Letters 361, 299-302.
Pinus strobus (Eastern white pine) contains stilbenes biosynthetically derived from cinnamoyl-CoA (pinosylvin) or dihydrocinnamoyl-CoA (dihydropinosylvin). We screened a P. strobus cDNA library with a stilbene synthase (STS) probe from Pinus sylvestris. The eight isolated cDNAs represented two closely related STS genes with five amino acid differences in the proteins. The enzyme properties were investigated after heterologous expression in Escherichia coli. Both proteins preferred cinnamoyl-CoA against dihydrocinnamoyl-CoA and thus represented pinosylvin synthases. Otherwise they revealed large differences. STS1 had only 3-5% of the activity of STS2, its pH optimum was shifted to lower values (pH 6), and it synthesized with cinnamoyl-CoA a second unknown product. Site-directed mutagenesis demonstrated that a single Arg-to-His exchange in STS1 was responsible for all of the differences. The proton acceptor properties of His are discussed as the reason for the properties of STS1.
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Billek, G., 1964. Stilbene im Pflanzenreich. In: Zechmeister, L. (Ed.), Fortschritte der Chemie Organischer Naturstoffe, Vol. 22. Springer-Verlag, Vienna, pp. 115-152.
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Billek, G., Schimpl, A., 1966. Biosynthesis of plant stilbenes. In: Billek, G. (Ed.), Biosynthesis of Aromatic Compounds, Pergamon Press, Oxford, pp. 37-44.
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Birch, A. J., Donovan, F. W., 1953. Studies in relation to biosynthesis. I. Some possible routes to derivatives of orcinol and phloroglucinol. Australian Journal of Chemistry 6, 360-368.
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Erdtman, H., 1963. Some aspects of chemotaxonomy. In: Swain, T. (Ed.), Chemical Plant Taxonomy, Academic Press, London, pp. 89-125.
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Ferrer, J.-L., Jez, J. M., Bowman, M. E., Dixon, R. A., Noel, J. P., 1999. Structure of chalcone synthase and the molecular basis of plant polyketide biosynthesis. Nature Structural Biology 6, 775-784.
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Fritzemeier, K.-H., Kindl, H., 1983. S9,10-Dihydrophenanthrenes as phytoalexins of Orchidaceae. Biosynthetic studies in vitro and in vivo proving the route from L-phenylalanine to dihydro-m-coumaric acid, dihydrostilbene and dihydrophenanthrenes. European Journal of Biochemistry 133, 545-550.
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Gorham, J., 1995. The Biochemistry of the Stilbenoids. Chapman & Hall, London.
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Ingham, J. L., 1976. 3,5,4'-trihydroxystilbene as a phytoalexin from groundnuts (Arachis hypogaea). Phytochemistry 15, 1791-1793.
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Keen, N. T., Ingham, J. L., 1976. New stilbene phytoalexins from American cultivars of Arachis hypogaea. Phytochemistry 15, 1794-1795.
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Kindl, H., 1985. Biosynthesis of stilbenes. In: Higuchi, T. (Ed.), Biosynthesis and Biodegradation of Wood Components, Academic Press, New York, pp. 349-377.
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Langcake, P., Pryce, R. J., 1977a. A new class of phytoalexins from grapevines. Experientia 33, 151-152.
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Langcake, P., Pryce, R. J., 1977b. The production of resveratrol and the viniferins by grapevines in response to ultraviolet irradiation. Phytochemistry 16, 1193-1196.
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Melchior, F., Kindl, H., 1990. Grapevine stilbene synthase cDNA only slightly differing from chalcone synthase cDNA is expressed in Escherichia coli into a catalytically active enzyme. FEBS Letters 268, 17-20.
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Preisig-Müller, R., Gnau, P., Kindl, H., 1995. The inducible 9,10-dihydrophenanthrene pathway: characterization and expression of bibenzyl synthase and S-adenosylhomocysteine hydrolase. Archives of Biochemistry and Biophysics 317, 201-207.
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Rupprich, N., Kindl, H., 1978. Stilbene synthases and stilbenecarboxylate synthases. I. Enzymatic synthesis of 3,5,4'-trihydroxystilbene from p-coumaroyl coenzyme A and malonyl coenzyme A. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie 359, 165-172.
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Samappito, S., Page, J. E., Schmidt, J., De-Eknamkul, W., Kutchan, T. M., 2003. Aromatic and pyrone polyketides synthesized by a stilbene synthase from Rheum tataricum. Phytochemistry 62, 313-323.
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Schoeppner, A., Kindl, H., 1979. Stilbene synthase (pinosylvine synthase) and its induction by ultraviolet light. FEBS Letters 108, 349-352.
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Sparvoli, F., Martin, C., Scienza, A., Gavazzi, G., Tonelli, C., 1994. Cloning and molecular analysis of structural genes involved in flavonoid and stilbene biosynthesis in grape (Vitis vinifera L.). Plant Molecular Biology 24, 743-755.
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Wiese, W., Vornam, B., Krause, E., Kindl, H., 1994. Structural organization and differential expression of three stilbene synthase genes located on a 13 kb grapevine DNA fragment. Plant Molecular Biology 26, 667-677.
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Yamazaki, Y., Suh, D.-Y., Sitthithaworn, W., Ishiguro, K., Kobayashi, Y., Shibuya, M., Ebizuka, Y., Sankawa, U., 2001. Diverse chalcone synthase superfamily enzymes from the most primitive vascular plant, Psilotum nudum. Planta 214, 75-84.
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Yu, C. K. Y., Springob, K., Schmidt, J., Nicholson, R. L., Chu, I. K., Yip, W. K., Lo, C., 2005. A stilbene synthase gene (SbSTS1) is involved in host and non-host defense responses in Sorghum. Plant Physiology 138, 393-401.
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Funktionelle Untersuchungen durch gezielte Mutagenese -
Lanz, T., Tropf, S., Marner, F.-J., Schröder, J., Schröder, G., 1991. The role of cysteines in polyketide synthases: site-directed mutagenesis of resveratrol and chalcone synthases, two key enzymes in different plant-specific pathways. Journal of Biological Chemistry 266, 9971-9976.
Resveratrol and chalcone synthases are related plant-specific polyketide synthases that are key enzymes in the biosynthesis of stilbenes and flavonoids, respectively. The stepwise condensing reactions correspond to those in other polyketide and fatty-acid synthases. This predicts that the two proteins also contain cysteines that are essential for enzyme activity because they bind the substrates. We exchanged, in both enzymes, all of the 6 conserved cysteines into alanine by site-directed mutagenesis and tested the mutants after expression of the proteins in the Escherichia coli heterologous system. Only cysteine 169 was essential in both enzymes, and inhibitor studies suggest that it is the main target of cerulenin, an antibiotic reacting with the cysteine in the active center of condensing enzymes. Most of the other exchanges led to reduced activities. In two cases, the enzymes responded differently, suggesting that the cysteines at positions 135 and 195 may be involved in the different product specificity of the two enzymes. The sequences surrounding the essential cysteine 169 revealed no similarity to the active sites of condensing enzymes in other polyketide synthases and in fatty acid biosynthesis. The available data indicate that resveratrol and chalcone synthases represent a group of enzymes that evolved independently of other condensing enzymes.
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Schröder, G., Schröder, J., 1992. A single change of histidine to glutamine alters the substrate preferences of a stilbene synthase. Journal of Biological Chemistry 267, 20558-20560.
Stilbene and chalcone synthases are related polyketide synthases which use the same substrates but from different products. The environment of the condensing active site cysteine is highly conserved, except for the positions -2 and -3. All chalcone synthases contain Gln-Gln and prefer 4-coumaroyl-CoA as starter CoA ester, while the two known stilbene synthases contain Gln-His or His-Gln (preference phenylpropionyl-CoA and 4-coumaroyl-CoA, respectively). We investigated whether the presence and/or position of the histidine influences the substrate preference and the product specificity (stilbene or chalcone). The two amino acid motifs in the chalcone synthase from Pinus sylvestris (Gln-Gln) and in the stilbene synthases from P. sylvestris (Gln-His) and Arachis hypogaea (His-Gln) were changed by site-directed mutagenesis into all sequence combinations as found in the natural enzymes. Assays with the mutant proteins showed that the histidine does not determine the product specificity. With the chalcone and the stilbene synthase from P. sylvestris, any sequence deviation reduced the activity without marked effects on the substrate preference. The stilbene synthase from A. hypogaea was different. The change from His-Gln to Gln-His abolished enzyme activity almost completely with all three substrates. The change to Gln-Gln selectively reduced the activity with 4-coumaroyl-CoA, and the kinetic analysis indicated a slight increase in Km and a 3-fold reduction of Vmax, when compared with the parent enzyme. This converted the enzyme from a resveratrol-forming into a dihydropinosylvin-forming stilbene synthase.
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Tropf, S., Lanz, T., Rensing, S. A., Schröder, J., Schröder, G., 1994. Evidence that stilbene synthases have developed from chalcone synthases several times in the course of evolution.
Journal of Molecular Evolution 38, 610-618.
Chalcone (CHS) and stilbene (STS) synthases are related plant- specific poly_ketide synthases that are key enzymes in the biosynthesis of flavonoids and of stilbene phytoalexins, respectively. A phylogenetic tree constructed from 34 CHS and four STS sequences revealed that the STS formed no separate cluster but grouped with CHS from the same or related plants. This suggested that STS evolved from CHS several times independently. We attempted to simulate this by site-directed mutagenesis of an interfamily CHS/STS hybrid, which contained 107 amino acids of a CHS from Sinapis alba (N-terminal) and 287 amino acids of a STS from Arachis hypogaea. The hybrid had no enzyme activity. Three amino acid exchanges in the CHS part (Gln-100 to Glu, Val-103 to Met, Val-105 to Arg) were sufficient to obtain low STS activity, and one additional exchange (Gly-23 to Thr) resulted in 20-25% of the parent STS activity. A kinetic analysis indicated (1) that the hybrids had the same Km for the substrate 4-coumaroyl-CoA but a lower V-max than the parent STS, and (2) that they had a different substrate preference than the parent STS and CHS. Most of the other mutations and their combinations led to enzymatically inactive protein aggregates, suggesting that the subunit folding and/or the dimerization was disturbed. We propose that STS evolved from CHS by a limited number of amino acid exchanges, and that the advantage gained by this enzyme function favored the selection of plants with improved STS activity.
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Tropf, S., Kärcher, B., Schröder, G., Schröder, J., 1995. Reaction mechanisms of homodimeric plant polyketide synthases (stilbene and chalcone synthase): a single active site for the condensing reaction is sufficient for synthesis of stilbenes, chalcones, and 6'-deoxychalcones. Journal of Biological Chemistry 270, 7922-7928.
Stilbene (STS) and chalcone (CHS) synthases are homodimeric, related plant-specific polyketide synthases. Both perform a sequential condensation of three acetate units to a starter residue to form a tetraketide intermediate that is folded to the ring systems specific to the different products. Protein cross-linking and site-directed mutagenesis identified a subunit contact site in position 158, close to the active site (Cys-169). This suggested that the active site pockets may be neighboring, possibly alternating in the condensing reactions rather than acting independently. This was investigated by coexpression of active site mutants with differently mutated, inactive proteins. With both STS and CHS, the heterodimers synthesized the end products, indicating that each subunit performed all three condensations. In co-action with a monomeric reductase, CHS also synthesizes 6'-deoxychalcone, but with the chalcone as second product when using plant preparations. The two enzymes expressed as single species in E. coli synthesized both products, and both were also obtained with a CHS heterodimer containing a single active site. The results showed that 6'-deoxychalcone synthesis required no other plant factor and that the formation of two products may be an intrinsic property of the interaction between dimeric CHS and monomeric reductase.
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