(Last
modification: 26.01.2010)
Typ III PKS: Eine Superfamilie von Polyketidsynthasen in
Pflanzen, Bakterien, und Pilzen
Unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Gudrun und Joachim Schröder)
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Typ III PKS Seiten
Anmerkung: Die Übersicht auf dieser Seite beschäftigt sich zur Hauptsache mit unseren eigenen Arbeiten. Jedoch, die neueren Ergänzungen (ab 2007) dehnen dies auf eine mehr allgemeine Beschreibung dieser interessanten Enzyme aus. Bitte den Links oben in der Titel-Leiste folgen!
Liste unserer Publikationen in diesem Arbeitsgebiet
Eine kurze Einführung/Übersicht
Pflanzen,
Bakterien, und Pilze enthalten eine Klasse von Polyketidsynthasen (PKS), die in mehrfacher Hinsicht einzigartig sind; sie werden häufig als
Typ III PKS bezeichnet, da sie nicht in die Gruppen der Typ I oder
Typ II PKS eingeordnet werden können: Typ III PKS sind relativ kleine
homodimere Proteine (Untereinheiten etwa 40-45 kDa), die im Regelfalle
iterative Kondensationen mit Malonyl-CoA durchführen; die Zahl kann von
eins bis sieben variieren. Die grundlegenden Mechanismen der kondensierenden Reaktion sind jedoch gleich; s. z.B. die
Reaktionen von Chalconsynthase (CHS).
Eine Übersicht über die Vielfalt der Reaktionen können Sie
hier finden.
In Pflanzen sind die bekanntesten Mitglieder dieser Superfamilie (und
tatsächlich die ersten, die beschrieben wurden!) die Enzyme, welche Chalcone (CHS) und Stilbene (STS) synthetisieren (siehe z.B. das wohlbekannte und vieldiskutierte Resveratrol:
mehr...). Die Reaktionsmechanismen dieser beiden Enzyme, und vor allem ihre Unterschiede (s.
Vergleich von CHS und STS) waren das Thema vieler Untersuchungen.
CHS katalysiert den ersten Schritt in der Biosynthese einer grossen Zahl von biologisch wichtigen Naturstoff-Produkten. STS synthetisiert das Grundgerüst der Stilbene; diese Enzyme sind relativ selten in Pflanzen. Die ersten Sequenzen für eine Resveratrol-synthetisierende STS wurden bereits in 1988 publiziert (Schröder et al., 1988). Neuere Ergebnisse legen nahe, dass Resveratrol eine weitaus wichtigere Rolle spielt als früher angenommen
(mehr...).
CHS and STS sind Pflanzen-spezifische Polyketidsynthasen; obwohl es verwandte Proteine in Bakterien gibt, benutzt keines der funktionell identifizierten Enzyme die gleichen Substrate. CHS und STS benutzen Starter-CoA-Ester vom Phenylpropanoid-Stoffwechsel. Sie führen drei Kondensationsreaktionen mit Malonyl-CoA durch, und dann falten sie das Tetraketid-Intermediat zu neuen aromatischen Ring-Systemen. Die kondensierenden Reaktionen sind in den beiden Enzymen identisch, aber die Ringschlüsse sind verschieden; sie führen entweder zu einem Chalcon oder zu einem Stilben (s. den
Vergleich). Die Sequenzen der beiden Enzyme sind eng verwandt (ca. 70% Identität auf der Protein-Ebene), und höchstwahrscheinlich entwickelten sich die heutigen
Pflanzen-STS mehrfach unabhängig in verschiedenen Pflanzenfamilien aus der CHS (Genduplikation der CHS, Mutationen zur neuen Funktion) (Tropf et al., 1994). Dies
ist vermutlich richtig für die Pflanzen-STS, aber es ist auch klar, dass
der Typ der Ringfaltung nicht pflanzenspezifisch ist: Er ist viel älter,
denn bereits in Bakterien gibt es mehrere Beispiele für den
gleichen Typ der Reaktion, aber eben mit anderen Substraten (mehr...).
Von besonderem Interesse sind die Enzyme mit langkettigen
Fettsäure-CoA-Estern als Substrate; sie könnten wohl Vorfahren der
Pflanzen-Enzyme sein. Völlig unklar ist jedoch, ob der Urahn der
Pflanzenenzyme vom CHS- oder STS-Typ war: Es gibt auch bakterielle Typ
III PKS, welche eine CHS-Typ Ringfaltung durchführen (mehr...).
Ein faszinierendes Thema ist, dass diese Superfamilie verwandte Proteine enthält, die prinzipiell die gleiche kondensierende Reaktion durchführen, aber mit ganz anderen Substraten (z. B. Benzoyl-CoA-Derivaten oder
aliphatischen CoA-Estern), und manche von ihnen machen nicht drei, sondern nur zwei oder sogar nur eine einzige Kondensations-Reaktion,
oder auch noch viel mehr. Ebenso können Reaktions-Zwischenstufen noch modifiziert werden. Die Summe solcher Variationsmöglichkeiten erklärt die grosse Vielfalt der Produkte, die von Proteinen dieser Familie gebildet werden können (Schröder 1997,
Schröder
2000). Die "active sites" der kondensierenden Reaktion sind konserviert, und eine "Signatur" für diese Funktionen wurde bereits vor langer Zeit definiert (PROSITE
Muster).
Das Konzept der Superfamilie erlaubt auch Vorhersagen für bis jetzt nicht identifizierte Enzyme in der Biosynthese von Naturstoffen, die bereits beschrieben wurden, und bei denen Vorstufen-Fütterungs-Experimente nahelegen, dass solche Reaktionen beteiligt sein sollten. In dem Zusammenhang: Was ist interessant am
Aroma von Himbeeren? Es wird von einem Enzym synthetisiert, welches nur eine Kondensationsreaktion durchführt. Interessant: Ähnliche Ein-Kondensationsreaktionen müssen auch in der Biosynthese anderer interessanter Naturstoffe postuliert werden
(mehr...) !!!
Und was noch interessant ist: Typ III PKS gibt
es nicht nur in Pflanzen, sondern auch in Bakterien (mehr...)
und Pilzen (mehr...) !!!
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Beispiele aus unseren Arbeiten zur Demonstration der vielfältigen Funktionen
Link zu einer
Übersicht
der Reaktionen in Pflanzen
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Evidenz, dass Typ III PKS an der Biosynthese von so komplexen Molekülen wie
Diarylheptanoiden und Phenylphenalenonen beteiligt sind.
Was ist daran so interessant? Fütterungsexperimente mit Vorstufen liessen schon vor Jahren den Schluss zu, dass die Biosynthese über eine erste Reaktion verlaufen sollte, die eine Kondensationsreaktion darstellt: Die Synthese eines Diketids (so wie in der Biosynthese des Hauptaromas in Himbeeren, s. oben). Jedoch, in der Biosynthese von
Diaryheptanoide und Phenylphenalenone werden die Intermediate durch mehrere Weiterreaktionen noch ausführlich modifiziert / zurechtgeschneidert. Die neue Arbeit liefert die erste direkte Evidenz, dass der erste Schritt tatsächlich durch
eine Typ III PKS durchgeführt wird!
Mehr...
Link zur
Publikation
-
Die Faltung zu verschiedenen Endprodukten bei STS und CHS:
Wie funktioniert das eigentlich?
Klicken Sie hier für eine Zusammenfassung der Ergebnisse !
Bei der Ähnlichkeit der beiden Reaktionen könnte man vermuten, dass die Erklärung nicht so kompliziert sein sollte. Tatsächlich ist sie es aber: Die ausserordentlich fähige Gruppe von J. Noel benötigte immerhin einige Jahre dazu. Wie sich jetzt herausstellt, sind es delikate elektronische Effekte, und nicht sterische Faktoren in der aktiven Tasche, wie lange vermutet wurde. Dies ist sicherlich eines der aufregendsten Ergebnisse der letzten Jahre, auch im Zusammenhang mit dem heutigen enormen Interesse an Resveratrol.
Links zu der Publikation
und zu der Übersicht über Resveratrol.
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Stilbencarboxylat-Biosynthese: Eine interessante Funktion in der Superfamilie
Dies ist die neueste Hinzufügung zu den versatilen Funktionen der Proteine in der Superfamilie . Im Prinzip handelt es sich um eine STS-Reaktion, bei der jedoch die terminale Carboxyl-Gruppe nicht abgespalten wird, und zusätzlich muss man eine Reduktions-Reaktion annehmen. Solche Stilbencarboxylate und ihre Derivate gibt es zu Hunderten in Lebermoosen, aber es gibt sie auch in einigen höheren Pflanzen, wie z.B. in der Hortensie. Einige von ihnen haben interessante Eigenschaften, wie z.B . Phyllodulcin aus der Hortensie, welche 600-800 mal süsser ist als Zucker. Vorstufen-Fütterungs-Experimente legten schon vor vielen Jahrzehnten nahe, dass Polyketidsynthasen an der Biosynthese beteiligt sein sollten. Wir interessierten uns dafür, weil dies eine ganz neue Funktion in der Proteinfamilie war. Ausserdem würde dies ganz neue Möglichkeiten in der biotechnologischen Anwendung zur Synthese neuer Substanzen eröffnen. Die Hortensie (Hydrangea macrophylla) war ein geeignetes Untersuchungsobjekt, da es einen relativ einfachen Satz an Stilbencarboxylaten und Derivaten enthält.
Einige von ihnen haben interessante Eigenschaften, e.g.
Phyllodulcin ist deine Substanz, die 600-800 x süsser als Zucker
ist. Und wieder: Was eigentlich auf der Oberfläche relativ einfach aussah, stellte sich als sehr kompliziert heraus: Werfen Sie einen Blick auf die Publikation:
Eckermann
et al. (2003)!
Mehr über
Hydrangea macrophylla und das Lebermoos
Marchantia polymorpha.
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Bestimmte Herbizide binden kovalent an das Cystein im aktiven Zentrum von CHS und STS
Eine interessante neue Entwicklung! Frühere Daten liessen vermuten, dass Chloroacetamid-Herbizide dadurch wirken, dass sie an aktive Cysteine im aktiven Zentrum der komplexen Enzym-Systeme binden, die für die Kettenverlängerung von sehr langen Fettsäuren verantwortlich sind. Der Nachweis war jedoch nicht möglich, da diese Enzymkomplexe membrangebunden sind und nicht ohne weiteres im Detail und mechanistisch analysierbar sind.
CHSs und die gesamte Proteinfamilie enthalten im aktiven Zentrum Cysteine, die absolut essentiell für die Enzymreaktion sind, und deshalb untersuchten wir dies, in einer sehr schönen Kooperation mit Kollegen in Konstanz ("die Herbizid-Leute") und Braunschweig ("der Massenspektrum-Spezialist"). Die Ergebnisse (Eckermann et al., 2003) sind komplex, und interessanterweise reagierten nicht alle Enzyme der Superfamilie gleich (was sehr interessant für Erklärungen der funktionellen Unterschiede sein könnte!). Mit CHS und STS waren sie jedoch ganz eindeutig: Das Chloroacetamid-Herbizid Metazachlor bindet tatsächlich kovalent an die -SH Gruppe des Cysteins im aktiven Zentrum (Eckermann et al., 2003).
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Die Protein Familie enthält eine Pyronsynthase (2PS) welche die Grundstruktur von Gerberin in Gerbera hybrida synthetisiert
Das Enzym führt nur zwei Kondensations-Reaktionen durch, und zwar mit Acetyl-CoA als Substrat! (Eckermann et al., 1998). Werfen Sie einen kurzen Blick auf die Reaktion! Eine der interessanten Eigenschaften des Enzyms ist, dass es Malonyl-CoA zu Acetyl-CoA dekarboxyliert, und sich damit sein eigenes Starter-Substrat herstellt. Keine Idee mehr wie Gerbera aussieht? Hier ist ein Bild einer
Blüte.
Sehen Sie sich weitere hochinteressante Ergebnisse an; aus einer schönen Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe J. Noel in U.S.A. (Jez
et al., 2000). Die Kristallstruktur der Pyronsynthase (2PS) zeigt, wie Substrat-Präferenz und die Zahl der Kondensations-Reaktionen kontrolliert werden: Es sind im wesentlichen sterische Effekte. Die aktive Tasche wird durch hereinragende "dicke" Aminosäuren-Seitenketten so verkleinert, dass nur noch kleine Substrate hineinpassen, und es ist auch nicht genug Platz für ein so grosses Molekül, wie es durch eine dritte Kettenverlängerung (dritte Kondensations-Reaktion) erzeugt würde. Diese Ergebnisse zeigen auch, wie man ganz "einfach" eine Chalconsynthase in eine solche Pyronsynthase umfunktionieren kann: Man braucht nur drei Aminosäuren auszutauschen! Die Ergebnisse sind in ein paar Darstellungen zusammengefasst, für diejenigen, die keine Zeit zum Lesen der Publikation haben: a) Ein
Sequenzvergleich: Welches sind die Schlüssel-Aminosäuren, welche die Grösse der aktiven Tasche bestimmen, d.h. die Begrenzung der Substratgrösse und der Zahl der Kondensations-Reaktionen; b) die Mutagenese-Experimente (Umwandlung der CHS in eine 2PS), and c) den Vergleich der Grösse und Form der aktiven Tasche von CHS und 2PS.
Anmerkung: Die erste Kristall-Struktur einer CHS wurde 1999 von der Gruppe J. Noel publiziert (Nature Struct. Biol. 6: 775-784, 1999): Ausgezeichnete Arbeit, die grundlegend und entscheidend für das mechanistische Verständnis der vielfältigen Funktionen in dieser Superfamilie ist (siehe Kommentar in
Schröder 1999). Dies wird auch wichtig sein für den "Reissbrett-Entwurf" von solchen Proteinen mit neuen Eigenschaften!
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C-Methylierte Chalcone werden wahrscheinlich durch CHS-Typ Enzyme mit speziellen Eigenschaften gebildet
(Schröder et al., 1998).
Dies wurde entdeckt nach der Identifizierung zweier CHS-Typ cDNAs in Pinus strobus: Die beiden Proteine waren 87.6% identisch, aber nur eines war eine echte CHS. Das zweite Protein war inaktiv mit allen typischen CHS-Substraten. Die Lösung des Problems ergab sich schliesslich aus der Kenntnis der Flavonoide in diesem Baum: Pinus strobus enthält ungewöhnliche
C-methylierte Flavonoide. Ihre Biosynthese war unbekannt, aber sie kann durch eine Reaktions-Abfolge erklärt werden, in welcher Methylmalonyl-CoA anstelle von Malonyl-CoA in der zweiten Kondensations-Reaktion verwendet wird. Das ist tatsächlich, was die zweite CHS (Pinus strobus CHS2) tut, und sie kann nur dies, wobei ein Methylstyron-Produkt freigesetzt wird. Unser Biosynthese-Modell schlägt deshalb vor, dass bei der Synthese solcher Chalcone zwei verschiedene CHSs mit verschiedenen Eigenschaften zusammenarbeiten (Heterodimer-Modell), ähnlich wie bei den Interaktionen mehrerer Proteine bei den modularen Polyketid-Synthasen in Bakterien.
Tatsächlich sprechen diese Überlegungen einen Punkt an, der in Zukunft von grosser Wichtigkeit sein wird: Wie interagieren solche Proteine mit anderen Proteinen, z.B. in komplexen Biosyntheseketten und kanalisierten Stoffwechselwegen? Bis jetzt gibt es überhaupt keine Vorstellungen darüber, obwohl die meisten davon ausgehen, dass solche Protein-Interaktionen essentiell sind.
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Biosynthese von Isoflavonoiden: Die Schlüssel-Reaktion ist die Synthese von 6'-Deoxychalcon
Es war lange Zeit ein Rätsel, wie die Biosynthese des postulierten 6'-Deoxychalcons vernünftig erklärt werden konnte. Des Rätsels Lösung war, dass hier eine CHS mit einer Reduktase interagierte, welche ein Intermediat der Chalcon-Synthese (entweder auf der Tri- oder der Tetra-Ketid-Ebene) an einer bestimmten Ketogruppe reduzierte. Die Reduktase wurde kloniert und es wurde nachgewiesen, dass sie tatsächlich mit der CHS zusammen das 6'-Deoxychalcon synthetisiert (Welle et al., 1991). Eines dieser Proteine wurde inzwischen kristallisiert und brachte interessante neue Erkenntnisse:
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Warum ist eine CHS-Typ Reaktion wichtig für Bier?
Das Grundgerüst der Aroma-gebenden Bittersäuren in Hopfen (Humulus lupulus) wird über eine interessante Reaktion synthetisiert: Es ist ein CHS-Typ Enzym, welches lineare CoA-Ester (z.B. Isovaleryl-CoA) als Substrat verwendet, damit drei Kondensationsreaktionen mit Malonyl-CoA durchführt, und das Produkt genauso wie eine typische CHS zu einem neuen Ring-System faltet. Das Enzym wird als Valerophenon-Synthase (VPS, nach dem Produkt mit Isovaleryl-CoA) genannt, und die Derivate des Valerophenons sind wichtige Komponenten für den Geschmack des Biers.
Eigentlich unterscheiden sich CHS und VPS nur durch die Substrate, nicht durch die Reaktion. Es war deshalb eine interessante Frage, ob eine typische CHS wohl mit Isovaleryl-CoA die gleichen Produkte bilden kann? Die Ergebnisse mit verschiedenen CHS, z.B. mit der aus der Kiefer (Pinus
sylvestris), zeigten ganz klar, dass CHSs das sehr wohl können. Man muss daraus schliessen, dass nur geringfügige Änderungen des Proteins notwendig sind, um eine CHS in eine VPS umzuwandeln (Zuurbier et al., 1998). Die Sequenzvon einigen 'echten' Valerophenon-Synthasen bestätigte die Ähnlichkeit mit CHS:
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Kann ein einziger Aminosäure-Austausch wichtige Eigenschaften einer Stilbensynthase verändern?
Ja, er kann, siehe Raiber et al., 1995: Die Arbeit beschreibt zwei Enzyme von Pinus strobus, bei denen ein einziger Arg-His Austausch einen drastischen Unterschied in den Enzymeigenschaften verursacht. Interessanterweise kann man aus Modellierungsversuchen (mit Hilfe der kristallisierten CHS, publiziert 1999) ableiten, dass wir eine Aminosäure identifizierten, welche wahrscheinlich an der Bindung des CoA-Anteils der Substrate beteiligt ist!
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Warum sind CHS und STS Dimere
?
Experimente mit Heterodimeren zeigen, dass ein einziges intaktes aktives Zentrum in einem Dimer ausreicht, damit Chalcone oder Stilben gebildet werden können. Vermutlich ist es so, dass die Untereinheiten bei der Bildung der Endprodukte interagieren. Sehen Sie die Publikation von Tropf et al. (1995) für die Einzelheiten; sie sind zu kompliziert für eine kurze Diskussion. Eine Zeitlang wurde in einigen Fällen beschrieben, dass andere Mitglieder der Superfamilie laut Grössenbestimmungen Monomere sein sollten, aber das wurde in keinem Falle überzeugend nachgewiesen. Ein interessanter solcher Fall ist die Acridon-Synthase, bei der erst nach sehr detaillierten und komplizierten Untersuchungen klar wurde, dass sie auch ein Dimer ist (Lukacin et al., 1999). Im übrigen zeigte die Kristallstruktur der CHS auch, dass die Proteine Dimere sind, und dies trifft auch für Stilbensynthasen zu.
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Kann man mit solchen Enzymen neue und interessante Substanzen synthetisieren?
Ja, ohne weiteres, denn alle diese Proteine sind nicht extrem wählerisch mit ihren Substraten. Sehen Sie als Beispiel die Publikation, die sich aus einer sehr fruchtbaren Kooperation mit einer Arbeitsgruppe in Japan ergab:
Morita
et al. (2001).
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CHS-verwandte Proteine in Bakterien
Dies ist ein faszinierendes Gebiet! Lange Zeit dachte man, dass diese Proteine pflanzenspezifisch sind, aber so ist es nicht! Gene für verwandte Proteine wurden bei vielen Gen-Projekten in Bakterien gefunden, und in einigen Fällen kennt man jetzt auch die Funktion:
Mehr.... Oder
gleich zu einer Publikation, an der ich beteiligt war: Biosynthese von
Dihydroxyphenylglycin.
Interessant: Dies ist eine Reaktion mit einer STS-Typ Ringfaltung,
aber sie ist ziemlich ungewöhnlich:
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